PB試驗結(jié)合BBD響應面法優(yōu)化冬蟲夏草菌菌絲體多糖的提取工藝*

查 昱 ，張宗豪 ，2，李秀璋 ，2，徐海峰 ，2，劉 欣 ，2，李玉玲 ，2**

（1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是線蟲草屬（Ophiocordyceps）中一味傳統(tǒng)中藥材，被稱為“中藥三大寶”[1-2]，研究多集中于化學成分分析和活性物質(zhì)藥效檢測[3-4]。隨著冬蟲夏草諸多藥效逐步被證實，交易金額隨之攀升[5-6]，一度造成人們對冬蟲夏草過度采挖，其所處生態(tài)環(huán)境遭到破環(huán)，大部分地區(qū)的冬蟲夏草產(chǎn)量也呈現(xiàn)下降趨勢[7]，冬蟲夏草資源面臨枯竭。為有效保護冬蟲夏草野生資源，其人工發(fā)酵技術(shù)進入人們視野，發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、易于實現(xiàn)工業(yè)化控制等優(yōu)點[8]。通過發(fā)酵所獲得的冬蟲夏草菌菌絲體，在化學成分、藥理活性方面與冬蟲夏草基本一致[9-10]，快速成為冬蟲夏草替代品，目前已有冬蟲夏草菌發(fā)酵菌絲制劑投入市場[11-12]。

冬蟲夏草菌菌絲體化學成分眾多，多糖是主要成分之一[13]。作為真菌多糖中的一類，被證實具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂、調(diào)節(jié)人體免疫等功能[14-15]。多糖提取是多糖利用的重要環(huán)節(jié)，有關真菌多糖的提取方法很多，常見的有熱水提取、酸提取、堿提取、微波提取、超聲波提取和酶法[16]，除單一提取方法，人們越來越多的聯(lián)合使用2種或多種提取方法，實現(xiàn)多糖最優(yōu)提取，如微波輔助、超聲波輔助提取等。

目前在實際生產(chǎn)應用及工藝優(yōu)化中，多用到Plackett-Burman（PB）設計結(jié)合 Box-Behnken（BBD）法進行試驗設計和數(shù)據(jù)處理，但在冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化方面的應用很少。通過運用PB試驗設計，對微波提取冬蟲夏草菌菌絲體多糖的影響因素進行篩選，應用BBD響應面設計對冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，以期建立一套實用、高效的多糖提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

冬蟲夏草菌 （Ophiocordyceps sinensis） 菌株，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院冬蟲夏草研究室提供。

1.1.2 儀器與設備

LE204E/02電子天平，托利多儀器有限公司；LDZH-200KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BS-2F恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市環(huán)宇科學儀器廠；TYM2011-8粉碎機，濟南天宇有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋，上海南陽儀器有限公司；5920R Eppendorf離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生有限公司；美的微波爐、PH030A干燥箱，上海-恒科技有限公司；90A冷藏冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)：將冬蟲夏草菌接于PDA斜面培養(yǎng)基18℃培養(yǎng)活化；后接入液體種子培養(yǎng)基于18℃、160 r·min-1培養(yǎng) 5 d～7 d；種子液培養(yǎng)結(jié)束后以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，18℃靜置擴大培養(yǎng)。

樣品預處理：將發(fā)酵所獲菌絲體用去離子水反復洗滌抽濾4次～5次，60℃條件下在恒溫干燥箱內(nèi)干燥至恒重。干燥的冬蟲夏草菌菌絲體用粉碎機破碎，將菌絲體粉末放置在4℃冰箱里備用。

1.2.2 菌絲體多糖提取工藝流程

醇沉濃度的選擇：設置5個處理，各處理分別稱取80目菌粉1 g，加入蒸餾水25 mL進行微波提取，微波功率350 W，微波時間2 min，過濾，濾渣重復提取1次。各處理分別加入50%、60%、70%、80%、90%無水乙醇靜置過夜，離心后將所獲沉淀依次用無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌烘干，稱重。

微波提取工藝流程：菌絲體粉末+蒸餾水→微波處理→離心→濃縮→乙醇沉淀→離心分離→洗滌沉淀→烘干→菌絲體粗多糖。

熱水浸提工藝流程：菌絲體粉末+蒸餾水→熱水浸提→離心→濃縮→乙醇沉淀→離心分離→洗滌沉淀→烘干→菌絲體粗多糖。

多糖得率（W，%）的計算公式為：

式中：G1為冬蟲夏草菌絲體粗多糖質(zhì)量（mg）；G2為樣品質(zhì)量（g）。

驗證試驗：采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)對樣品進行處理，與模型預測多糖得率值進行比較。工藝流程同 1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用Design-Expert 8.0.5軟件進行PB試驗設計篩選影響顯著因素，再采用BBD試驗設計優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉濃度的選擇

醇沉濃度對多糖提取的影響見圖1。

由圖1可知，當醇沉濃度增大多糖提取率也隨之增大，直至醇沉濃度達到80%時多糖提取率趨于穩(wěn)定，這可能是因為隨著醇沉濃度的增大菌粉內(nèi)其他非糖物質(zhì)開始溶出從而抑制了多糖的溶出。綜合上述試驗結(jié)果，醇沉濃度采用80%為佳。

2.2 微波提取單因素試驗結(jié)果

2.2.1 分樣篩目數(shù)對菌絲體多糖提取的影響

在料液比1∶25、提取次數(shù)2次、微波功率350 W、微波時間2 min的條件下，分別采用分樣篩40目、60目、80目、100目、120目，研究不同分樣篩目數(shù)對多糖提取的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨所用分樣篩目數(shù)的增大所獲多糖也越多，但當所用分樣篩目數(shù)超過80目時，多糖得率趨于穩(wěn)定，選取80目為佳。

2.2.2 料液比對菌絲體多糖提取的影響

在分樣篩目數(shù)為80目、提取次數(shù)2次、微波功率350 W、微波時間2 min的條件下，分別采用料液比為 1∶20、1 ∶25、1∶30、1∶35、1∶40，研究不同料液比對多糖提取的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當料液比為1∶25時，測得多糖最多，得率達5.2%，但當料液比超過時1∶25時，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于水的增加阻礙了微波功效，因此以料液比1∶25為佳。

2.2.3 提取次數(shù)對菌絲體多糖提取的影響

在分樣篩目數(shù)為80目、料液比為1∶25、微波功率350 W、微波時間2 min的條件下，選取提取次數(shù)1次、2次、3次、4次、5次，研究不同提取次數(shù)對多糖提取的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當提取3次時，測得多糖最多，得率達6.5%，但當提取次數(shù)大于3次時，會增加濃縮難度，多糖得率也出現(xiàn)下降的趨勢，本著經(jīng)濟節(jié)約的原則以3次提取次數(shù)為最佳。

2.2.4 微波功率對菌絲體多糖提取的影響

在分樣篩目數(shù)為80目、提取次數(shù)2次、料液比1∶25、微波時間2 min的條件下，選取微波功率分別為300 W、350 W、400 W、450 W、500 W，研究不同微波功率對多糖提取的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當微波功率為350 W時，多糖得率達6.3%，當微波功率超過350 W時，多糖得率則出現(xiàn)不同程度下降趨勢，這可能是因為過高的微波功率會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，影響多糖提取，因此以處理功率350 W為佳。

2.2.5 微波時間對菌絲體多糖提取的影響

在分樣篩目數(shù)為80目、提取次數(shù)2次、料液比1∶25、微波功率350 W的條件下，選取微波時間分別為 1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，研究不同微波時間對多糖提取的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當微波時間為3 min時，測得多糖最多，得率達6%，3 min以前多糖得率隨時間的增加不斷加大，微波起到破壁作用使多糖不斷溶出，當微波時間超過3 min時，可能是微波破壞多糖結(jié)構(gòu)或是降解已溶出多糖，使多糖得率下降，因此以處理時間3 min為佳。

2.3 Plackett-Burman試驗結(jié)果

綜合以上單因素試驗結(jié)果，運用Design-Expert軟件進行PB試驗設計，對影響冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取的5個影響因素進行顯著性試驗。每個影響因素取2個水平，以高水平（1） 和低水平（-1） 表示，以多糖得率作為評價指標。各影響因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2，模型方差分析結(jié)果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Tab.1 Plackett-Burman test factor level table

表2 Plackett-Burman試驗設計及結(jié)果Tab.2 Plackett-Burman test design and results

表3 Plackett-Burman模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of Plackett-Burman model

由表3可知，5個因素對冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取率的回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果。料液比對多糖提取影響極顯著（P<0.01），微波功率、微波時間對多糖提取影響顯著（P<0.05），顯著性大小依次為料液比>微波功率>微波時間。因此選擇具有顯著影響的3個因素，料液比（B）、微波功率（D）、微波時間（E）作為下一步響應面模型的考察因素。

2.4 Box-Behnken設計優(yōu)化

綜合單因素試驗及PB試驗結(jié)果，選取料液比、微波功率、微波時間為考察因素，以冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取率為響應值進行分析。運用Design-Expert軟件進行響應面設計，3個因素各設高、中、低3個水平，分別用1、0、-1表示，因素水平表見表4，試驗設計及結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 Box-Behnken試驗因素水平表Tab.4 Box-Behnken test factor level table

表5 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Tab.5 Box-Behnken test design and results

由表6可知，此模型P<0.000 1有統(tǒng)計學意義，決定系數(shù)R2=0.987 3，該模型可以準確反應各因素對多糖提取的影響；校正系數(shù)R2adj=97.11%，該模擬可解釋97.11%的響應值變化情況；失擬項P=0.072 4>0.05，試驗中未考慮進去的因素對試驗結(jié)果影響??；變異系數(shù)為2.6%<10%，所得模型與實際試驗擬合程度高；信噪比25.028，該模型精密度好，響應信號強。綜合以上各數(shù)據(jù)表明，該模型可以作為冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取的預測模型。

為進一步探究各因素間交互作用及與響應值的關系，給出直觀可視圖形，運用Design-Expert軟件分析得到該模型響應面立體圖譜，詳見圖7～圖9。

表6 Box-Behnken模型方差分析Tab.6 Analysis of variance of Box-Behnken model

由圖7～圖9可知，料液比、微波功率的增加對多糖得率的影響呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，微波時間走勢較平緩，因此在提取過程中適當增加料液比、微波功率都可提高多糖提取率。

由Design-Expert軟件分析得出最佳微波提取工藝參數(shù)為：料液比1∶26.08、微波功率329.6 W、微波時間4 min，在此條件下多糖提取率可達9.19%。結(jié)合實際情況并考慮操作中各儀器能夠達到的控制范圍，將所得理論因素參數(shù)修正為，料液比為1∶26，微波功率為330 W，微波時間為4 min。

2.5 驗證試驗

稱取分樣篩80目冬蟲夏草菌菌絲體粉末，用優(yōu)化后的提取參數(shù)對樣品進行處理并浸提3次，所得多糖提取率為9.06%，與模型預測值相差0.13%。此模型預測性良好，可作為優(yōu)化冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取工藝的預測模型。

2.6 2種多糖提取工藝結(jié)果比較

應用相同試驗設計對傳統(tǒng)熱水浸提多糖工藝進行探究，結(jié)果表明在熱水浸提工藝下，5種影響因素目數(shù)、料液比、提取次數(shù)、浸提時間、浸提溫度中對多糖提取率具有顯著影響的有料液比、浸提次數(shù)、浸提溫度。對熱水浸提、微波提取多糖工藝結(jié)果進行比較。

經(jīng)響應面優(yōu)化后冬蟲夏草菌菌絲體多糖得率達8.56%，與微波提取工藝（9.06%） 相比低0.50%。雖然熱水浸提成本低廉、操作簡單、對多糖活性破環(huán)小，但其耗時長、浸提溶劑使用量大、提取率低。若以多糖得率為指標，冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取過程中優(yōu)選微波提取為佳。

3 結(jié)論與討論

針對青海省冬蟲夏草菌菌絲體進行試驗，在微波提取工藝的單因素試驗基礎上結(jié)合Plackett-Burman試驗，篩選出對冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取影響顯著因素，再運用響應面法優(yōu)化得到最佳提取工藝參數(shù)。同時運用相同試驗設計對比熱水提取與微波提取工藝，以多糖得率為指標優(yōu)選微波提取工藝，確定微波提取的最佳工藝參數(shù)為：分樣篩目數(shù)為80目、料液比為1∶26、浸提次數(shù)為3次、微波功率為330 W、微波時間為4 min，此條件下冬蟲夏草菌菌絲體多糖得率達9.06%，與模型預測值接近。

冬蟲夏草菌菌絲體多糖藥理作用廣泛，要對其加以應用，多糖的提取是首要任務。不同提取方式所得多糖提取率不同，劉帥[17]對比4種冬蟲夏草菌菌絲體多糖提取工藝，以多糖得率為指標優(yōu)選微波輔助提取法為最佳提取工藝，所獲多糖得率達6.76%，高于盛嘉俊[18]優(yōu)化方法下的冬蟲夏草菌菌絲體多糖得率。彭日煌[19]利用多種方法對江西國藥菌粉進行多糖得率測定，以多糖得率為指標優(yōu)選微波提取工藝最佳，多糖得率達9.22%，高于邵紫培[20]利用超聲波提取西藏那曲冬蟲夏草菌菌絲體多糖得率，但與本試驗中優(yōu)選多糖提取工藝相同，多糖得率相近。冬蟲夏草菌菌絲體多糖得率不僅與提取方法有關，與所發(fā)酵過程中用的菌株也有關聯(lián)。對于不同提取工藝所獲冬蟲夏草菌菌絲體多糖除在得率之間有差異，是否對多糖結(jié)構(gòu)也會產(chǎn)生改變而影響其功能活性還未有報道，有待進一步探究。