牛冠狀病毒、牛諾如病毒和牛嵴病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

王文佳，徐照學(xué)，蘭亞莉*，師志海*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；3.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002)

犢牛腹瀉(calf diarrhea，CD)是一種影響犢牛健康，進(jìn)而影響優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品生產(chǎn)的嚴(yán)重病癥。在美國，CD是斷奶前犢牛死亡的首要原因[1]，韓國[2]、伊朗[3]等國也有類似報道。CD給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。近年來，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，CD的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響犢牛早期的生長發(fā)育和后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮。同時，因其死亡率高，亦嚴(yán)重影響牛群的更新和養(yǎng)牛業(yè)的良性發(fā)展[5]。此外，在CD的防治過程中，大多以抗生素治療為主，易產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)的問題[6]。另外，受病原感染的牛提供給人類的乳、肉制品，會成為人類感染某些病原的潛在傳播媒介，給人類的生命健康和公共衛(wèi)生安全帶來實質(zhì)性威脅[7]。

CD病因復(fù)雜，包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲以及環(huán)境等其他生物學(xué)因子，給臨床防制帶來了極大地困難。盡管說細(xì)菌、病毒、寄生蟲等都可引起CD，但病毒可通過急性、持續(xù)性或潛伏性感染引起腹瀉類疾病[5]，在CD中扮演重要角色。近年來，特別是對與CD相關(guān)病毒的研究日益受到全球病毒學(xué)界及相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的青睞，并成為研究熱點。牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)是冠狀病毒科、冠狀病毒屬的單股正鏈RNA病毒，可引起CD、成年牛冬痢和呼吸道疾病。犢牛感染多發(fā)于5～30日齡。牛諾如病毒(bovine norovirus，BNoV)是杯狀病毒科、諾如病毒屬的無囊膜單股正鏈RNA病毒。1978年首次在英國腹瀉犢牛的糞便中被發(fā)現(xiàn)[9]，2018年首次在我國腹瀉牛糞便中被檢測到[10]。牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKV)，又名Aichivirus B，是無囊膜的RNA病毒。2003年首次在健康牛血清和糞便中被發(fā)現(xiàn)[11]，2008年在腹瀉牛糞便中被檢測到[12]，2013年首次在我國西北部地區(qū)奶牛群中檢測到[13]。關(guān)于BNoV和BKV的流行病學(xué)在我國尚無相關(guān)報道，以及BKV在CD中扮演的角色還存在爭議，有待于更多的研究求證。基于此，本試驗建立BCoV、BNoV和BKV多重PCR檢測方法，并在河南部分地區(qū)規(guī)?；霾杉瘶悠愤M(jìn)行檢測，以期為BCoV、BNoV和BKV的疫情監(jiān)控、臨床檢測、綜合防控及分子流行病學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料2017年9月—2018年5月，127份腹瀉犢牛(<4月齡)糞便樣本采集自河南規(guī)?；?表1)，全部樣品單獨分裝，詳細(xì)記錄品種、年齡、采樣日期、樣品數(shù)量等信息。牛冠狀病毒(BCoV)、牛諾如病毒(BNoV)、牛嵴病毒(BKV)、牛星狀病毒(bovine astrovirus,BAstV)、牛輪狀病毒(bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛紐布病毒(bovine nebovirus,BNeV)陽性樣品均由本實驗室鑒定保存。

表1 樣品信息

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Premix Taq，DNA Marker 2000，pMD 18-T，DH5α均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit，Plasmid Mini Kit均為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 核酸提取127份糞便樣品，用PBS 按1∶10混懸，漩渦震蕩，4℃ 8 000 r/ min離心5 min，收獲上清，-80℃保存用于后續(xù)實驗。病毒RNA的提取參照提取試劑盒，-80℃保存病毒RNA；cDNA的反轉(zhuǎn)錄參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，-20℃保存。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的BCoV和BNoV病毒基因的保守序列，利用Premier 5.0軟件對該2種病毒的基因保守區(qū)域分別設(shè)計1對引物，預(yù)計擴(kuò)增BCoV NSP1-2 基因部分片段896 bp，BNoV RdRp基因部分片段542 bp；BKV的引物參考其他文章[14]，擴(kuò)增BKV 3D基因部分片段216 bp。引物由華大基因生物科技有限公司合成，引物信息見表2。

表2 引物信息

1.4 PCR擴(kuò)增對多重PCR反應(yīng)的引物、模板等用量進(jìn)行優(yōu)化和多次重復(fù)試驗后確定最佳反應(yīng)體系。將反應(yīng)退火溫度從45～56℃依次遞增，多次重復(fù)試驗后確定最佳退火溫度。每次設(shè)置陰性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.5 特異性試驗用建立的多重PCR方法對BCoV,BNoV,BKV,BRV,BAstV,BVDV,BNeV進(jìn)行檢測。

1.6 敏感性試驗用上述引物分別對BCoV、BNoV和BKV的陽性樣品進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別與pMD18-T載體連接，構(gòu)建陽性質(zhì)粒。用超微量核酸蛋白分析儀測定所構(gòu)建的陽性質(zhì)粒的濃度，計算模板質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將陽性質(zhì)粒10倍梯度稀釋后進(jìn)行多重PCR的敏感性試驗。

1.7 重復(fù)性試驗以構(gòu)建的陽性質(zhì)粒為模板，用建立的多重PCR方法每隔1周重復(fù)檢測1次，連續(xù)檢測3次，以驗證該方法的可靠性和重復(fù)性。

1.8 應(yīng)用性試驗用所建立的多重PCR方法對127份臨床腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測，并與用單一PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR體系的構(gòu)建及優(yōu)化通過對退火溫度及引物濃度等條件的優(yōu)化，最終確定該多重PCR體系包括Premix Taq 10 μL，BCoV，BNoV和BKV的上/下游引物各0.25 μL，模板1 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。退火溫度最佳為52℃，最佳反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 1 min，52℃ 1 min,72℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min。

以BCoV，BNoV和BKV的單一模板和混合質(zhì)粒為模板，用建立的多重PCR同時擴(kuò)增，以ddH2O做陰性對照。結(jié)果顯示，多重PCR分別擴(kuò)增出BCoV約896 bp，BNoV約542 bp和BKV約216 bp 大小的目的片段(圖1)。所有擴(kuò)增出的特異性目的片段均經(jīng)過測序驗證。

圖1 BCoV、BNoV、BKV單一和多重PCR擴(kuò)增 M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV、BNoV和BKV的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2.BNoV單一PCR產(chǎn)物;3.BCoV單一PCR產(chǎn)物;4.BKV單一PCR產(chǎn)物;5.陰性對照

2.2 特異性試驗用建立的多重PCR方法檢測不同的陽性樣品。結(jié)果表明，本試驗建立的多重PCR方法具有良好的特異性(圖2)。

圖2 多重PCR的特異性 M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV,BNoV 和 BKV多重PCR擴(kuò)增;2～8.分別是BNoV,BKV,BCoV,BRV,BAstV,BVDV,BNeV的PCR產(chǎn)物;9.陰性對照

2.3 敏感性試驗結(jié)果顯示，用建立的多重PCR方法對BCoV，BNoV和BKV的最低檢測限分別為9.51×105，5.39×105和2.23×106copies/μL(圖3)。

圖3 多重PCR的敏感性 M.DL2000 DNA Marker;1～8.108～101 copies/μL BCoV+108～101 copies/μL BNoV+109～102 copies/μL BKV;9.陰性對照

2.4 重復(fù)性試驗用建立的多重PCR方法對同一模版進(jìn)行檢測，3次試驗結(jié)果一致(圖4)，表明該方法重復(fù)性良好。

圖4 多重PCR的重復(fù)性 A,B,C.分別代表第1,3和5周的PCR M.DL2000 DNA Marker;1.BCoV+BNoV+BKV;2.BNoV;3.BCoV;4.BKV;5.陰性對照

2.5 應(yīng)用性檢測用建立的多重和單一PCR對127份臨床樣品進(jìn)行檢測，部分臨床樣品檢測結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，所建立的多重PCR方法檢測出的BCoV，BNoV和BKV的陽性數(shù)分別為19份(陽性率為14.96%)，8份(陽性率為6.30%)和6份(陽性率為4.72%)；并檢出BCoV、BNoV和BKV共感染的樣品2份(陽性率為1.57%)(表2)。檢測結(jié)果與單一PCR檢測結(jié)果符合率為100%。表明該方法能夠快速準(zhǔn)確的檢測此3種病毒。

圖5 部分臨床樣品的檢測 M.DL2000 DNA Marker;1～15.臨床樣品;16.陰性對照

3 討論

CD病因復(fù)雜，找出致病原因，做出準(zhǔn)確診斷，采取相應(yīng)措施是成功控制CD的關(guān)鍵。然而，在過去很長一段時間，有關(guān)CD的病原學(xué)調(diào)查都局限在細(xì)菌領(lǐng)域。近年來，關(guān)于病毒性病原在CD病因中的角色與地位越來越多的受到各國學(xué)者的關(guān)注，逐漸成為全世界病毒學(xué)界及相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的研究熱點[15-16]。近年來，BKV和BNoV等病毒在我國牛群中陸續(xù)被檢測到，應(yīng)引起我國相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的關(guān)注和重視。目前，在我國關(guān)于BKV和BNoV的流行狀況、致病力以及分子遺傳進(jìn)化分析等方面的相關(guān)報道甚少，本試驗建立的檢測方法為彌補(bǔ)此空白提供可靠的技術(shù)手段。

表3 臨床樣品的檢測結(jié)果

BCoV,BNoV和BKV均與CD有關(guān)[17]，并且三者有可能被同時檢測到，僅靠臨床鑒別診斷難以判定，從而給疾病的及時防治帶來不便。傳統(tǒng)的病毒檢測方法如電鏡觀察、病毒分離鑒定、血清學(xué)試驗等，存在費時費力、特異性差、試驗周期長等不足，準(zhǔn)確快速的診斷技術(shù)對此3種病毒的檢測顯得尤為重要。多重PCR技術(shù)可同時檢測多種病原體，在鑒別診斷上應(yīng)用價值較大，尤其是混合感染[18]。本試驗建立的多重PCR診斷方法，可同時檢測此3種病毒。運用該方法檢測其他能夠引起CD的病毒性病原，均無條帶，說明特異性良好。另外使用該方法對BCoV,BNoV和BKV的模板(1 μL)最低能檢測到3.74 pg的BCoV,1.91 pg的BNoV和7.10 pg的BKV，敏感性較高。該方法可用于臨床樣品中BCoV，BNoV和BKV的快速檢測。用所建立的多重PCR方法對127份CD糞便樣品進(jìn)行檢測，其中，BCoV、BNoV和BKV的檢出率分別為14.96%，6.30%，4.72%。本試驗中BKV的檢出率低于CHANG等[13]報道的檢出率(34.9%)，可能與樣本數(shù)量、飼養(yǎng)管理、生態(tài)條件等因素有關(guān)。

本試驗通過優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)條件，建立的BCoV，BNoV和BKV多重PCR檢測方法，能從糞便樣品中成功檢測出BCoV，BNoV和BKV，特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，可為此3種病毒的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供有力的技術(shù)支持。