風(fēng)流草總醇提物對衰老大鼠骨質(zhì)的影響研究?

薛 帆，宋晶珠，裴凌鵬△

(1. 中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081； 2. 民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

在一定時(shí)間內(nèi)大劑量D-半乳糖攝入可導(dǎo)致機(jī)體衰老，而伴隨衰老過程常會(huì)誘發(fā)骨質(zhì)的變化，對于研究致衰老繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制具有一定的理論意義與臨床價(jià)值[1-2]。 水族源于古代“百越”族系，由秦漢時(shí)期“西甌”族的“駱越”一支發(fā)展演變而來[3]。其先民在長期與惡劣自然環(huán)境和疾病的斗爭中，積累了防病治病的豐富經(jīng)驗(yàn)，形成了獨(dú)特的水族醫(yī)藥，是結(jié)合中醫(yī)、苗醫(yī)、壯醫(yī)、瑤醫(yī)以及布依醫(yī)的具有云貴高原藥物學(xué)特點(diǎn)和民族特色的醫(yī)藥體系[4]。風(fēng)流草又稱壯陽草、接骨草[5]，為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，屬水族習(xí)用藥材，其水藥名為“罵都領(lǐng)”。野生落葉小灌木，高約1.5 m，莖圓柱狀有縱溝、無毛。葉互生，羽狀復(fù)葉，小葉1～3枚，頂生小葉矩形至線形，葉柄長1.1～2 cm。頂生花序圓錐狀，花紫紅色，莢果鐮形或直，節(jié)5～9個(gè)，花期秋季。據(jù)《水族骨傷醫(yī)藥》記載，其性味苦平，歸肝腎經(jīng)，具有祛瘀生新、舒筋活絡(luò)作用，主治強(qiáng)壯筋骨、風(fēng)濕骨痛、骨折等[6]。 本實(shí)驗(yàn)旨在通過風(fēng)流草總醇提物對D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)相關(guān)指標(biāo)(如骨密度、骨生物力學(xué)參數(shù)、血清鈣磷含量、骨羥脯氨酸含量、骨堿性磷酸酶活性等)的研究，初步評(píng)價(jià)其對上述模型的效果，進(jìn)而探索這一傳統(tǒng)水族草藥可能的藥效學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

雙能X線骨密度測定儀、島津萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)、火焰原子吸收分光光度計(jì)、全自動(dòng)生化儀(日本島津公司)；HPLC(美國Waters公司)；752分光光度計(jì)(中國伯樂公司)； D-半乳糖、大孔吸附樹脂(北京化學(xué)試劑公司)；鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素、Goldners染料、乙醇； 風(fēng)流草(采自貴州黔南三都水族自治縣都柳江畔)。

1.2 風(fēng)流草植物鑒定

所采樣本經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系楊瑤珺教授鑒定為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，俗稱為風(fēng)流草。

1.3 風(fēng)流草總醇提物制備

1000 g風(fēng)流草枝葉曬干、粉碎，60目篩備用，70%乙醇5000 mL回流提取2次，每次2 h，離心過濾，合并清液冰凍真空干燥制成干粉。

1.4 造模與給藥方法

6周齡SD大鼠(雌雄各半)36只，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心(批號(hào)ZKYX-201703010)。36只大鼠隨機(jī)分為3組，即模型組、幼齡對照組和風(fēng)流草總醇提物組(即藥物組)每組各12只。另購16月齡同品系大鼠(雌雄各半)12只作為老齡對照組。模型組和藥物組用D-半乳糖頸背部皮下注射，每天1次，每次20 mg/kg，其中藥物組用風(fēng)流草總醇提物每天灌胃1次，每次20 mg/kg(依據(jù)臨床習(xí)用量人/鼠折算)。其他各組均以等量生理鹽水注射，每天1次，連續(xù)飼養(yǎng)5個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有動(dòng)物麻醉處死，收取雙側(cè)股骨，測定骨長度、骨質(zhì)量、骨密度、骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)指標(biāo)、骨羥脯氨酸含量、骨堿性磷酸酶(ALP)活性以及對骨組織構(gòu)成進(jìn)行分析，采血分離血清進(jìn)行鈣磷含量測定。本實(shí)驗(yàn)已通過中央民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)的測定 按之前的方法進(jìn)行骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)的測定[7]。取大鼠股骨,用千分尺測量右側(cè)股骨長度，用分析天平稱量兩側(cè)股骨的重量， 將左股骨標(biāo)本進(jìn)行 3 點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn), 得到載荷-撓度曲線。 由此，曲線可直接得出大鼠骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)(最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度)。測定參數(shù):下壓速度 10 mm/min，下壓幅度 4 mm，保持時(shí)間 5 s，跨度 22 mm。 將股骨斷開后, 取股骨中部做徑向切片, 在顯微鏡下用顯微尺測量股骨的最大外徑 A、最小外徑 B、最大內(nèi)徑 a、最小內(nèi)徑 b， 計(jì)算出大鼠股骨的各項(xiàng)生物力學(xué)指標(biāo)。

1.5.2 骨密度測定 按之前的方法進(jìn)行骨密度測定[8]。取出股骨解凍后于Lunar- XR型雙能X線骨密度測定儀測骨密度,分骨近段、中段、遠(yuǎn)段三部分測其骨密度。測定位置為前后位,測試標(biāo)本置于塑料盤內(nèi),內(nèi)盛適量生理鹽水浸沒標(biāo)本,掃描整個(gè)標(biāo)本后選定測定區(qū)域得出各骨密度值。近段和遠(yuǎn)段代表松質(zhì)骨骨密度,骨中段代表皮質(zhì)骨骨密度。測定參數(shù):掃描寬度 20 nm,掃描速度 7 mm· s-1。

1.5.3 血清鈣磷含量的測定 血清中Ca、P含量根據(jù)試劑盒說明由全自動(dòng)生化儀進(jìn)行分析。

1.5.4 骨組織構(gòu)成觀察 按之前的方法進(jìn)行骨組織構(gòu)成觀察[9]。采用圖像分析儀測定大鼠股骨上段不脫鈣骨的骨髓腔中脂肪細(xì)胞、血竇和紅骨髓面積比，其中將脂肪組織和血竇面積視為白骨髓面積，而剩余面積為紅骨髓面積，紅骨髓面積與白骨髓面積之和即為骨髓腔面積。

1.5.5 骨羥脯氨酸含量、ALP活性測定 方法詳見[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨長度、質(zhì)量變化

表1示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨長度與質(zhì)量均有所升高(P<0.05)，模型組與老齡對照組比較有所降低(P<0.05)；與模型組比較，藥物組骨長與質(zhì)量均有所升高(P<0.05)。

表1 不同處理組間股骨骨長度、質(zhì)量比較

2.2 骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

表2、3示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)指標(biāo)均有所降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物組股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)與生物力學(xué)參數(shù)指標(biāo)有所升高(P<0.05)。

表2 股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 骨密度指標(biāo)測定結(jié)果

表4示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨不同部位骨密度均有所降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物組股骨不同部位骨密度有所升高(P<0.05)。

表4 股骨各部位骨密度測量比較

2.4 血清鈣磷含量測定結(jié)果

表5示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組血清鈣磷含量均有所升高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組血清鈣磷含量均有所降低(P<0.05或P<0.01)。

表5 血清鈣、磷含量比較

2.5 骨組織構(gòu)成觀測

表6示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組骨髓面積增加而紅骨髓面積減少(P<0.05或P<0.01)，白骨髓中脂肪組織增多(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，藥物組骨髓腔中白骨髓面積減少(P<0.01)，而紅骨髓面積增加，脂肪組織減少，血竇組織增加(P<0.05或P<0.01)。

表3 股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

表6 骨髓組織構(gòu)成觀測比較

2.6 骨羥脯氨酸含量、ALP活性測定結(jié)果

表7示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組骨羥脯氨酸含量、ALP活性均有所降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，藥物組骨羥脯氨酸含量、ALP活性均有所升高(P<0.05)。

表7 骨羥脯氨酸含量、ALP活性

3 討論

水族藥用植物大多有活血通絡(luò)、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧的能力。云貴高原生長的水藥材如五爪金龍等，在治療骨傷慢性疾病、自身免疫性疾病和老年病等常見病方面有顯著作用，且毒副作用小[6]。水族醫(yī)生認(rèn)為，傷后疼痛大多是因?yàn)轲鲅?、邪毒以及血液缺失等原因?qū)е卵毫魉贉p慢，或者是血管堵塞，進(jìn)而造成血液無法通過血脈導(dǎo)致疼痛。風(fēng)流草具有祛瘀生新、舒筋活絡(luò)作用，對骨傷疾病有一定的治療作用。

在一定時(shí)間內(nèi)大量進(jìn)食D-半乳糖造成細(xì)胞外積累效應(yīng)，可誘發(fā)大量自由基的產(chǎn)生，從而影響機(jī)體正常自由基代謝過程。而多余的自由基極易攻擊細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)以及核膜，尤其是對膜脂雙分子結(jié)構(gòu)及質(zhì)膜上的離子通道影響較大。此外，對于線粒體內(nèi)裸露的mtDNA同樣具有破壞作用，進(jìn)而影響細(xì)胞呼吸鏈的正常功能，造成細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變與功能的喪失，誘發(fā)機(jī)體的衰老。隨著機(jī)體衰老程度的加劇，過剩的自由基從整體、細(xì)胞和基因不同水平層次影響骨代謝,使繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率也逐步升高[11-12]。在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病類型中，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率占主導(dǎo)地位，主要特征包括骨礦密度減低、骨微結(jié)構(gòu)破壞以致骨的力學(xué)能力下降、骨脆性增強(qiáng)等。在骨重建過程中，一方面自由基可以通過多種途徑破壞膠原蛋白形成，如減少羥脯氨酸的合成，影響骨膠原的生成，而膠原不僅為骨礦化提供重要場所，同時(shí)還與骨細(xì)胞的發(fā)育、生長和活性調(diào)節(jié)有主要關(guān)系，其含量、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性直接影響到骨微結(jié)構(gòu)和骨力學(xué)特性。因此其一旦發(fā)生變化，則會(huì)導(dǎo)致骨脆性增強(qiáng),也可使骨中礦物質(zhì)沉積減少，從而加速骨礦物質(zhì)的溶出，影響骨密度，抑制骨的形成[13-16]。由于骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)建成受阻，同時(shí)礦物質(zhì)含量下降，從而使骨的生物力學(xué)受到影響，大大降低骨的抗變性能力，提高了發(fā)生骨折的幾率[17]。另一方面，D-半乳糖也可與體內(nèi)蛋白生成晚期糖化終末產(chǎn)物AGEs，隨其濃度增加，直接或間接影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的活性，造成血清鈣磷含量、ALP活性的變化，打破骨形成-骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，影響骨重建[18]。與此同時(shí)，骨質(zhì)疏松還會(huì)引發(fā)體內(nèi)脂代謝紊亂，造成骨髓脂肪細(xì)胞增多，引起骨髓腔內(nèi)壓增高而使血流減慢，從而影響骨內(nèi)血供不足，進(jìn)而加劇骨代謝的抑制作用[19]。與幼齡對照組比較，模型組各項(xiàng)骨質(zhì)指標(biāo)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其變化雖與老齡對照組存在一定差距，但呈現(xiàn)的病程趨勢類似。而經(jīng)過一定時(shí)間風(fēng)流草總醇提物的適量攝入，其模型組的上述指標(biāo)均有一定的改善。

風(fēng)流草總醇提物對D-半乳糖導(dǎo)致的衰老模型大鼠血清鈣磷含量有所提高，改善大鼠因D-半乳糖致衰老所誘發(fā)的骨質(zhì)變化。但是流草總醇提物對D-半乳糖導(dǎo)致的衰老模型大鼠起作用的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入探討。