益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響?

張 軍，孫佳佳，劉 穎，趙 靜，袁 潔，戴金穎，王順意

(1. 河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北 唐山 063000； 2. 華北理工大學，河北 唐山 063210)

胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗是2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)生發(fā)展的主要病理生理學特征[1]。胰島β細胞功能受損被認為是T2DM發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)[2]。因此，修復胰島β細胞功能成為治療T2DM的關鍵。胰島素是人體內(nèi)惟一具有降糖作用的激素，磷酸化磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路。研究發(fā)現(xiàn)，該通路存在于胰島β細胞內(nèi)，為胰島素信號通路之一[3]。 磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1)是該通路中的關鍵蛋白因子，它在維持胰島β細胞增殖生長中起重要作用。近年來熱點研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論使用益氣養(yǎng)陰活血中藥可有效改善胰島β細胞功能。本實驗旨在通過測定胰島細胞中 PI3K、 PDK1蛋白表達，探討益氣養(yǎng)陰活血方改善T2DM大鼠胰島β細胞功能的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級8周齡健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(220±20)g，飼養(yǎng)于華北理工大學動物實驗中心(動物許可證號SCXK(京)2017-0001)，室溫20 ℃～25 ℃，濕度45%～60%，光照節(jié)律(12 h/12 h)，實驗過程中動物自由攝食飲水。本實驗已通過華北理工大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物

益氣養(yǎng)陰活血方組成：黃芪12 g，黃精12 g，太子參12 g，當歸12 g，鬼箭羽15 g，丹參20 g，三七3 g，地黃12 g，葛根15 g，牡丹皮10 g等(選用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥免煎顆粒，購自唐山市中醫(yī)醫(yī)院)。

1.3 主要試劑和儀器

生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(美國ADL公司)；兔源PI3K多克隆抗體(bs-0128R)、兔源PDK1多克隆抗體(bs-3788R)(北京博奧森生物科技有限公司)；羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

血糖儀及配套試紙(德國拜耳公司拜安進血糖儀)；離心機(美國Thermo Fisher科技公司)；Shandon325型石蠟切片機(英國Shandon公司)；DYY-7型轉移電泳儀(北京市六一儀器廠)；恒溫震蕩搖床(上海?，攲嶒炘O備有限公司)；Image Pro Plus圖像分析軟件(美國Media Cybemetics公司)。

2 方法

2.1 T2DM大鼠模型建立

60只大鼠分籠處理，普通飼料喂養(yǎng)7 d。隨機選取正常組(normal control,NC組)10只喂以普通飼料，造模組50只喂以高脂飼料，連續(xù)28 d。在第29天，將大鼠禁食12 h并向模型鼠腹腔內(nèi)一次性注射35 mg/kg STZ溶液(溶于PH 4.5 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液)。造模大鼠72 h后尾靜脈取血，測血糖值16.7 mmol/L作為T2DM模型造模成功的標準。7 d后對未達標準的大鼠進行再次注射STZ處理，仍未達到16.7 mmol/L標準的大鼠有2只被剔除。

2.2 分組及藥物干預

成功建模的48只大鼠按體質(zhì)量分層，按隨機數(shù)字表法分為模型組(diabetes mellitus,DM)、津力達組(jinlida,JLD)、益氣養(yǎng)陰活血方高劑量組(yiqi yangyin huoxue prescription-high dose, YYHP-H)、中劑量組(yiqi yangyin huoxue prescription-middle dose, YYHP-M)、低劑量組(yiqi yangyin huoxue prescription-low dose, YYHP-L)。于每日上午9時灌胃，正常組和模型組給予相同體積的生理鹽水，津力達組以1.5 g/(kg·d)灌胃，益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組按成人劑量的6.25倍，以4∶2∶1給藥，即高劑量組(55.00 g/kg)、中劑量組(27.50 g/kg)、低劑量組(13.75 g/kg)，將中藥顆粒溶于適量水中，每只大鼠以2 mL/d給藥干預28 d。由于造模及灌胃過程中的損耗，除正常組外最終有43只大鼠納入統(tǒng)計，其中NC組10只，DM組9只，JLD組8只，YYHP-H組9只，YYHP-M組9只，YYHP-L組8只。

2.3 指標檢測

2.3.1 空腹血糖測定 應用拜耳公司血糖儀及配套試紙尾尖采血定期測定大鼠FBG。

2.3.2 ELISA法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS) 最后1次給藥后將大鼠禁食，次日上午8時進行麻醉、固定、解剖，腹主動脈取血、靜置、離心、分離血清，稀釋樣品，向已經(jīng)包被過空腹胰島素抗體的酶樣板中加入樣品和標準品，室溫孵育1 h加入二抗、HPR，分別經(jīng)過覆蓋、孵育后加入顯色底物，室溫避光反應30 min，加入終止液。終止反應后進行OD值檢測，繪制標準曲線，最終計算得出實際樣本濃度。

2.3.3 HOMA-IR及HOMA-β計算 根據(jù)已測定的血清胰島素水平計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment insulin resistance, HOMA-IR)及胰島素分泌指數(shù)(Islet β cell secretion index, HOMA-β)，計算公式如下：胰島素抵抗指數(shù)[4]：HOMA-IR=(FBGxFINS)/22.5；胰島素分泌指數(shù)[5]：HOMA-β=FINS×20/(FBG-3.5)。

2.3.4 免疫組化法測定胰島細胞中PI3K、PDK1蛋白表達 將部分胰尾組織進行固定、脫水、透明、浸蠟包埋后切片，通過sp法進行免疫組織化學染色，將4 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟再水化，檸檬酸修復液高壓修復抗原，雙氧水清除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加10%山羊血清封閉30 min。滴入一抗(PI3K 1∶500,PDK1 1∶500)，濕盒4 ℃孵育過夜，除去一抗逐滴加入二抗，并在37 ℃繼續(xù)溫育20 min。滴加DAB，在顯微鏡下監(jiān)測染色程度，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化幾秒，反藍，脫水、透明、封片，光鏡下觀察蛋白表達，免疫組化結果應用Image Pro Plus(IIP)6.0軟件進行半定量分析，測定PI3K、PDK1平均光密度。

2.3.5 蛋白免疫印跡法測定胰島細胞中PI3K、PDK1的蛋白表達 將部分液氮處理后的胰尾組織裂解，離心提取上清后按BAC試劑盒說明操作進行蛋白定量，剩余蛋白樣品加上樣緩沖液沸水浴變性稍離心。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒壓、轉膜各2 h，取下帶有蛋白質(zhì)的PVDF膜，5%脫脂奶粉搖床封閉。加一抗(PI3K 1∶1000,PDK1 1∶1000)4 ℃靜置過夜，TBS搖床清洗，加入二抗室溫搖床孵育，ECL化學發(fā)光并顯影定影。圖片掃描后，應用Image Pro Plus(IIP)6.0 圖像分析軟件進行蛋白灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參β-tubulin條帶的灰度值之比作為各目的蛋白的相對表達。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR、HOMA-β檢測結果

表1示，與正常組比較，模型組FBG和HOMA-IR水平顯著升高，F(xiàn)INS和HOMA-β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，津力達組和益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組FBG水平下降，F(xiàn)INS和HOMA-β水平升高，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組HOMA-IR水平降低(P<0.01)，其余各給藥組HOMA-IR水平也有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與津力達組比較，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組FBG水平均有不同程度降低，F(xiàn)INS和HOMA-β水平均有不同程度升高，而以中劑量組效果最佳(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β水平比較

注：A1. 正常組；B1. 模型組；C1. 津力達組；D1. 高劑量組；E1. 中劑量組；F1. 低劑量組圖1 各組大鼠胰腺組織胰島細胞內(nèi)PI3K蛋白表達(×400)

3.2 免疫組化法測定大鼠胰腺組織胰島細胞內(nèi)PI3K、PDK1蛋白表達

圖1、2示，在光學顯微鏡下觀察，PI3K、PDK1在胰島細胞中的表達區(qū)域為棕黃色，主要在細胞質(zhì)和細胞膜表達。正常組的PI3K、PDK1蛋白陽性表達最高，染色為深棕色(A1、A2)；模型組的陽性表達最少，染色為淺黃色(B1、B2)；與模型組比較，津力達組和益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組蛋白表達均有所增強，其中中劑量組表達增強最明顯(C1-F1,C2-F2)。表2示，應用圖像分析系統(tǒng)分析計算各組圖片的平均光密度值，結果顯示與正常組比較，模型組PI3K、PDK1蛋白的表達降低(P<0.01)；與模型組比較，津力達組和益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組PI3K、PDK1蛋白表達明顯升高(P<0.01，P<0.05)；與津力達組比較，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組PI3K蛋白表達升高(P<0.05)，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組PDK1蛋白表達均存在不同程度的升高(P<0.05)，而以中劑量組效果最優(yōu)(P<0.05)。

表2 各組大鼠胰腺組織胰島細胞內(nèi)PI3K、PDK1蛋白表達水平比較

3.3 免疫蛋白印跡法測定大鼠胰腺組織胰島細胞內(nèi)PI3K、PDK1蛋白表達

圖3示，與正常組比較，模型組胰島細胞中PI3K、PDK1蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，津力達組及益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組胰島細胞中PI3K、PDK1蛋白表達升高(P<0.01)；與津力達組比較，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組PI3K、PDK1蛋白表達明顯升高(P<0.01)，而以中劑量組效果最佳(P<0.05)。

4 討論

2型糖尿病是環(huán)境和遺傳因素共同作用形成的異質(zhì)性糖代謝性疾病，其發(fā)病機制的2個重要環(huán)節(jié)是胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗。胰島素分泌功能的降低和胰島β細胞數(shù)量的減少是胰島β細胞功能受損的主要表現(xiàn)。英國UKPDS表明，患者診斷為糖尿病時其胰島β細胞功能只有正常人的一半，并以每年4%～5%的速度下降[6]。因此，改善胰島β細胞功能和數(shù)量已成為治療2型糖尿病的關鍵。

注：與NC組比較：△△P<0.01；與DM組比較：**P<0.01；與JLD組比較：◇◇P<0.01；與中劑量組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01圖3 各組大鼠胰腺組織胰島細胞內(nèi)PI3K、PDK1蛋白表達比較

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴病”范疇?！鹅`樞·五變》記載：“五臟皆柔弱者，善病消癉”，《醫(yī)方考》[7]記載“消渴，無水也”，指出先天稟賦不足陰虛燥熱而致消渴，氣虛運血無力、燥熱耗傷津液而致瘀血內(nèi)生，形成氣陰兩虛兼瘀之證，其為2型糖尿病的主要證型，與臨床相關調(diào)查結果一致[8]。本研究將中醫(yī)辨證論治與現(xiàn)代藥理相結合，選用已在臨床中大量應用且被證實能有效降糖的自擬益氣養(yǎng)陰活血方。方中黃芪、太子參大補元氣；丹皮、葛根、地黃、黃精生津涼血，氣陰雙補；當歸、鬼箭羽、丹參、三七補血活血化瘀，益氣養(yǎng)陰與活血化瘀藥物相配伍，起到補不礙邪、攻不傷正、標本同治之功。方中黃芪葛根配伍，不僅能夠降低炎癥因子IL-6水平，改善炎癥狀態(tài)，還能通過提高胰島素水平從而控制血糖，效果均優(yōu)于單一用藥[9]。黃精多糖可上調(diào)胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2,IRS-2)的表達，改善胰島素抵抗狀態(tài)，抑制胰腺免疫損傷和自由基損傷，減少胰島β細胞凋亡，降低高糖狀態(tài)，抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[10]。鬼箭羽具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善血液流變學的作用，對血瘀證2型糖尿病具有明顯的治療作用[11]。丹參多酚鹽通過增加抗氧化酶的活性，進而發(fā)揮抗氧化應激作用來修復胰島β細胞[12]。目前西藥類降糖藥對胰島β細胞功能的保護機制尚不明確，因此對照組藥物選用具有益氣養(yǎng)陰、生津健脾功效的津力達顆粒。津力達顆粒以“運脾津”為治則，組方中君藥為人參益氣健脾，氣旺津生；黃連、蒼術、苦參清熱燥濕；麥冬、黃精補脾養(yǎng)陰；佩蘭芳香醒脾；茯苓、知母養(yǎng)陰暢脈；荔枝核行散滯氣；淫羊藿溫補脾經(jīng)腎經(jīng)陽氣；何首烏、山萸肉補肝腎之陰，加用丹參祛瘀生新，全方具有益脾氣、養(yǎng)脾陰、通脈絡的配伍特點。與本實驗所用中藥方組方原則相近。大量動物實驗及臨床實驗[13-14]也證實,津力達顆?？捎行Т龠MT2DM胰島細胞恢復，增加胰島素分泌，改善胰島素抵抗，控制血糖,其作用明確，無明顯低血糖和肝腎損害等不良反應，存在良好可比性。

PI3K/Akt信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是胰島素發(fā)揮作用的主要途徑。其中 PI3K/Akt作為促生存信號通路，在胰島細胞增殖、生長和凋亡過程中起重要作用。PI3K是胰島素信號朝向調(diào)節(jié)糖代謝方向傳導的關鍵信號分子，其處于胰島素受體底物IRS后，胰島細胞內(nèi)的胰島素與胰島素受體(insulin receptor,IR)結合使其自身磷酸化并與IRS結合，IRS與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基結合使 PI3K被激活催化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3)，其產(chǎn)物PIP3被認為是胰島素第二信使。PDK1、PDK2作為PI3K的下游信號分子，在PIP3作用下活化并將Akt蛋白聚集到細胞膜上，在PDK1作用下分別使Akt蛋白上的第437位絲氨酸磷酸化位點(Ser437)和第308位蘇氨酸磷酸化位點(THr308)發(fā)生磷酸化，激活Akt信號通路[15]。相關實驗證明，激活PI3K/Akt信號通路可以保護胰島β細胞，促進胰島素分泌，有效調(diào)節(jié)血糖[16]。

本實驗研究采用STZ誘導建立2型糖尿病大鼠模型，結果表明，益氣養(yǎng)陰活血方可有效調(diào)節(jié)血糖，促進胰島素分泌。免疫組化結果顯示，益氣養(yǎng)陰活血方高、中、低劑量組的大鼠胰島細胞中PI3K和PDK1蛋白表達均有不同程度升高；蛋白印跡法結果與其相一致，且中劑量組效果最佳。另有袁潔等[17]對益氣養(yǎng)陰活血方治療的大鼠胰島細胞行HE染色，結果顯示，胰島細胞均有不同程度的改善，胰島細胞中miRNA-375表達水平明顯下降。Ouaammari[18]等發(fā)現(xiàn)，miR-375能夠通過抑制PI3K、PDK1的表達，調(diào)節(jié)葡萄糖誘導的生物學效應，提示益氣養(yǎng)陰活血方對胰島β細胞功能的改善作用，可能是通過下調(diào)胰島細胞中miRNA-375的表達，進而激活PI3K/Akt信號通路，促進其下游關鍵蛋白PDK1蛋白表達來實現(xiàn)的。此外本實驗結果顯示，實驗大鼠胰島細胞受損和胰島素抵抗同時存在，益氣養(yǎng)陰活血方在改善胰島細胞功能和胰島素抵抗方面均有明顯優(yōu)勢。

綜上所述,益氣養(yǎng)陰活血方能夠增強T2DM大鼠胰島細胞內(nèi)PI3K、PDK1蛋白表達，促進胰島素分泌，改善胰島素抵抗狀態(tài)，有效降低大鼠血糖；其修復胰島β細胞功能的作用機制可能是通過提高PI3K和PDK1蛋白表達、激活PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)的。