米脂小米多糖的提取及其體外抗氧化性能*

高晶晶，慕 苗，陳錦中，劉麗娜

(榆林學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

小米具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的碳水化合物、脂肪、維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸等[1-2]。陜北米脂小米因其營(yíng)養(yǎng)更為豐富成為中國(guó)著名的小米之一[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，米脂小米含有更多的蛋白質(zhì)和脂肪，更是含有8種人體必需的氨基酸，營(yíng)養(yǎng)比例更加適合[4-5]。

多糖是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的高分子碳水化合物[6-7]，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)、延緩衰老、降血糖、抗輻射、抗菌抗病毒、保護(hù)肝臟等作用[8-14]。作者以陜北米脂小米為研究對(duì)象，對(duì)其中的多糖進(jìn)行提取研究，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了米脂小米多糖的提取工藝路線，然后對(duì)多糖進(jìn)行了體外抗氧化性能測(cè)定，為小米多糖的后續(xù)應(yīng)用研究提供了一定理論基礎(chǔ)[15]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

陜北米脂小米：購(gòu)自陜西米脂縣。

濃硫酸：四川西隴科學(xué)有限公司；乙醇、苯酚：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；抗壞血酸(Vc)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司；水楊酸、鄰苯三酚、FeSO4：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；H2O2、濃HCl：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；以上所用試劑均為分析純。

電子天平：FA1004，上海良平儀器儀表有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1900，日本島津公司；醫(yī)用離心機(jī)：TL80-2，姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，北京科偉永興有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測(cè)定及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多糖的檢測(cè)采用苯酚-硫酸法在490 nm處測(cè)其吸光度值[16]。配制質(zhì)量濃度分別為0、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取2 mL，分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液，立即加入5 mL濃硫酸，混合均勻靜置30 min，待冷卻后，在490 nm處測(cè)吸光度值[17]。

1.2.2 多糖提取率的計(jì)算

多糖提取率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

η=ρ×V×Nm×100%

(1)

式中：η為小米多糖的提取率，%；ρ為檢測(cè)液多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗多糖溶解定容后的總體積，L；m為原料小米質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

小米預(yù)處理：將小米與w(乙醇)=95%溶液混合于三口燒瓶中，設(shè)置溫度為50 ℃，水浴加熱3 h進(jìn)行脫脂，后晾干備用。

準(zhǔn)確稱取10 g脫脂后的小米置于三口燒瓶中，加入一定量的蒸餾水，在恒溫水浴下攪拌，提取一定時(shí)間后，過(guò)濾，取上清液，加入3倍體積w(乙醇)=95%溶液進(jìn)行醇沉，4 500 r/min離心30 min，取沉淀。溶解沉淀并定容，用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖的含量，計(jì)算多糖提取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)只能體現(xiàn)出各個(gè)因素單獨(dú)對(duì)提取率的影響，而響應(yīng)面優(yōu)化法可以得出各個(gè)因素間的交互作用對(duì)提取率的影響[18]。因此，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選提取時(shí)間、攪拌速率、V(提取液)∶m(小米)(以下簡(jiǎn)稱“液料比”)3個(gè)對(duì)多糖提取率影響較大的因素，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)的基本原理[19-21]，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到該提取過(guò)程的數(shù)學(xué)模型。

1.2.5 小米多糖抗氧化性測(cè)定

1.2.5.1 對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除率的測(cè)定

配制濃度為0.2 mmol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液，置于棕色瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。取經(jīng)分離純化后的小米多糖配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液，取不同質(zhì)量濃度待測(cè)液各2 mL，加入DPPH·乙醇溶液2 mL，搖勻，避光靜置30 min，分光光度計(jì)于517 nm下測(cè)定其吸光度值。同時(shí)還需做空白對(duì)照及同條件下Vc的DPPH·清除率的測(cè)定[22]。具體計(jì)算見(jiàn)公式(2)。

X=(1-A0-A1A2)×100%

(2)

式中：X為DPPH·清除率，%；A0為小米多糖和DPPH·混合液的吸光度值；A1為小米多糖和空白溶劑(無(wú)水乙醇)混合液的吸光度值；A2為DPPH·溶液和空白溶劑混合液的吸光度值。

1.2.5.2 對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定

取一定量小米多糖凍干粉配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液。取2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和2 mL水楊酸各5份置于不同試管中，搖勻后分別加入上述不同質(zhì)量濃度的樣品2 mL，最后各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3% 的H2O22 mL，37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，分光光度計(jì)于510 nm下測(cè)定其吸光度值。同時(shí)還需做空白對(duì)照及同條件下Vc的羥基自由基清除率的測(cè)定[23]。具體計(jì)算見(jiàn)公式(3)。

Y=A0-A1A0×100%

(3)

式中：Y為羥基自由基清除率，%；A0為空白對(duì)照的吸光度值；A1為多糖溶液的吸光度值。

1.2.5.3 對(duì)超氧陰離子清除率的測(cè)定

取一定量的小米多糖凍干粉配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液各1 mL，各加入濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)3 mL，置于30 ℃恒溫水浴20 min，各加入7 mmol/L鄰苯三酚3 mL，搖勻，反應(yīng)4 min后，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)。分光光度計(jì)于320 nm下測(cè)其吸光度值。同時(shí)還需做空白對(duì)照及同條件下Vc的超氧陰離子清除率的測(cè)定[24]。具體計(jì)算見(jiàn)公式(4)。

Z=(1-A0-A1A2)×100%

(4)

式中：Z為超氧陰離子清除率，%；A0為多糖溶液的吸光度值；A1為以H2O代替鄰苯三酚的吸光度值；A2為以H2O代替多糖溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

ρ(葡萄糖)/(μg·mL-1)

由圖1可知，A與ρ(葡萄糖)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各影響因素對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2a可知，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加而增大，4 h時(shí)提取率最大，之后隨著時(shí)間的增加提取率逐漸減小。因?yàn)橛脽崴釙r(shí)多糖從小米的內(nèi)部由固相傳遞至液相需要一段較長(zhǎng)的時(shí)間，在4 h后，多糖的穩(wěn)定性下降，一部分多糖分解，導(dǎo)致多糖提取率反而降低[25]。因此，確定提取時(shí)間為4 h。由圖2b可知，多糖提取率隨溫度的升高增加，因?yàn)闇囟鹊纳呖梢约涌旆肿娱g的運(yùn)動(dòng)使物質(zhì)的黏度減小，傳質(zhì)阻力減小，物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大，所以傳質(zhì)速度逐漸變大，在50 ℃達(dá)到了最大值。之后多糖提取率隨著溫度的升高反而減小，是因?yàn)闇囟鹊睦^續(xù)升高會(huì)導(dǎo)致部分多糖分解[26]。因此，確定最佳提取溫度為50 ℃。由圖2c可知，多糖的提取率隨著液料比的增加而增加，在液料比為20∶1 mL/g時(shí)多糖的提取率達(dá)到最高，隨著液料比的繼續(xù)增加，多糖的提取率反而降低，說(shuō)明過(guò)多的提取液反而不利于提取，因此，確定最佳液料比為20∶1 mL/g。由圖2d可知，隨著攪拌速率的增加，多糖的提取率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明適當(dāng)?shù)脑黾訑嚢杷俾蕦?duì)多糖的提取有一定的加強(qiáng)作用，在30 r/min后，多糖的提取率變化不大，基本上趨于平穩(wěn)，說(shuō)明攪拌的加強(qiáng)作用已經(jīng)不明顯。因此，確定攪拌速率為30 r/min。

提取時(shí)間/ha 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

以提取率為響應(yīng)值R，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出提取時(shí)間(A)、攪拌速率(B)和液料比(C)這3個(gè)對(duì)提取率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，多糖提取模型的建立及方差分析見(jiàn)表3。

表1 設(shè)計(jì)因素與水平編碼表

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與多糖提取率

續(xù)表

由表3可知，響應(yīng)面優(yōu)化法所擬合的陜北小米多糖提取模型為顯著(P=0.008 6<0.01)，該模型失擬項(xiàng)P=0.794 4>0.01為不顯著，說(shuō)明該模型誤差小，用于該提取過(guò)程是科學(xué)合理可靠的。由模型的P值可知(P值越小，說(shuō)明該項(xiàng)對(duì)提取率的影響越大)，X2和X22是顯著的影響因素，因此，攪拌速率對(duì)提取率起著關(guān)鍵的作用，攪拌速率的輕微變化都會(huì)對(duì)小米多糖提取率有較大的影響[27]。不顯著的影響因素為X1、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X21、X23，根據(jù)P值的比較可知攪拌速率影響程度大于提取時(shí)間影響程度大于液料比影響程度。

表3 陜北小米多糖提取模型方差分析

對(duì)以上的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與擬合可以得到該提取模型的回歸方程為：

Y=1.05+0.050X1+0.15X2+0.030X3+0.034X1X2+0.032X1X3+0.011X2X3-0.058X21-0.14X22-0.047X23

2.3.2 各因素間交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間交互影響的立面圖，見(jiàn)圖3～圖5。立面圖中越陡峭的一方其對(duì)提取的影響越大。由圖3可知，攪拌速率對(duì)陜北小米多糖提取率的影響大于提取時(shí)間的影響；由圖4可知，提取時(shí)間的影響略大于液料比的影響；圖5可知，且小米多糖提取率的影響要明顯大于液料比的影響。由此可得，攪拌速率對(duì)陜北小米多糖的提取率影響最大，其次是提取時(shí)間和液料比，與方差分析得出的結(jié)論一致。

圖3 提取時(shí)間和攪拌速率交互作用對(duì)多糖提取率的影響

圖4 提取時(shí)間和液料比交互作用對(duì)多糖提取率的影響

圖5 液料比和攪拌速率交互作用對(duì)多糖提取率的影響

2.3.3 最優(yōu)條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面得到的提取模型可以預(yù)測(cè)最佳提取時(shí)間為4.3 h，攪拌速率為36 r/min，液料比為20∶1 mL/g，該條件下預(yù)測(cè)陜北小米多糖提取率為1.051 4%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出陜北小米多糖的平均提取率為1.046 7%，與預(yù)測(cè)值1.051 4%接近，證明上述響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)是準(zhǔn)確可靠的。

2.4 小米多糖體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定結(jié)果

ρ(小米多糖)及ρ(Vc)對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖6。

ρ/(mg·mL-1)

由圖6可知，ρ(Vc)和ρ(小米多糖)增加的同時(shí)，DPPH·的清除率也在增加。質(zhì)量濃度相同時(shí)，Vc對(duì)DPPH·的清除率均要高于小米多糖。小米多糖清除DPPH·的IC50值為0.095 mg/mL。

2.4.2 對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

小米多糖及Vc對(duì)羥基自由基的清除作用見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著ρ(Vc)和ρ(小米多糖)的增加，羥基自由基的清除率也在隨之增加。質(zhì)量濃度相同，Vc對(duì)羥基自由基的清除率要高于小米多糖。小米多糖清除羥基自由基的IC50值為0.78 mg/mL。

ρ/(mg·mL-1)

2.4.3 對(duì)超氧陰離子清除率的測(cè)定結(jié)果

ρ(小米多糖)及ρ(Vc)對(duì)超氧陰離子的清除作用見(jiàn)圖8。

由圖8可知，隨著ρ(小米多糖)和ρ(Vc)的增加，對(duì)超氧陰離子的清除率也在增加。在超氧陰離子清除的實(shí)驗(yàn)中，Vc的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小米多糖的清除率。小米多糖清除超氧陰離子的IC50值為0.42 mg/mL。

3 結(jié) 論

對(duì)陜北米脂小米中多糖進(jìn)行了提取工藝研究，采用單因素法和響應(yīng)面優(yōu)化法相結(jié)合的方法對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到優(yōu)化的提取工藝路線為提取溫度50 ℃，提取時(shí)間4.3 h，攪拌速率36 r/min，液料比20∶1 mL/g，在該條件下陜北小米多糖的平均提取率為1.046 7%。陜北小米多糖的體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，小米對(duì)DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子均具有一定的清除作用，其IC50值分別為0.095，0.78，0.42 mg/mL，說(shuō)明其具有一定的抗氧化性，且小米多糖的抗氧化性能與其質(zhì)量濃度有著一定的量效關(guān)系，質(zhì)量濃度越高，抗氧化性越強(qiáng)。