HPLC法測(cè)定不同時(shí)期鮮棗中環(huán)磷酸腺苷含量變化的研究

苗瀲涓，侯艷霞，宿炳林，郝瑞芳，常 寧，盧桂賓

(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系，山西 太原 030009)

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是在人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，是生命傳遞的“第二信使”，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)和新陳代謝。據(jù)報(bào)道，在目前所有測(cè)得的動(dòng)植物樣品中，cAMP含量在棗中是最高的。cAMP檢測(cè)大多采用蛋白免疫結(jié)合法、高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法等。本試驗(yàn)以鮮棗為研究對(duì)象，通過(guò)纖維素酶水解浸提，提取鮮棗樣品中的活性成分cAMP，采用高效液相色譜法，測(cè)定不同品種鮮棗中cAMP的含量，同時(shí)檢測(cè)不同成熟期鮮棗樣品中cAMP含量的變化，為后期開發(fā)棗功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

鮮棗(包括木棗、壺瓶棗、板棗3種)，采自山西省農(nóng)科院果樹所國(guó)家棗種質(zhì)資源圃。

1.1.2 試劑與儀器

試劑與儀器見第2頁(yè)表1.

表1 試劑與儀器

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用純水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4 ℃，可穩(wěn)定1個(gè)月。分別吸取cAMP貯備液0.1 mL，0.2 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL加到100 mL容量瓶?jī)?nèi)，配制成1.0 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10 μg/mL，15 μg/mL，20 μg/mL濃度系列標(biāo)準(zhǔn)液，過(guò)0.45 μm有機(jī)系濾膜，備用待測(cè)。

1.2.2 樣品預(yù)處理

將3種鮮棗切條干燥，粉碎機(jī)磨成粉末并過(guò)篩，棗粉備用。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g棗粉，熱水溶解后65 ℃溫水浴1 h，取出后冷卻到室溫，檸檬酸調(diào)節(jié)pH為5.0.加入纖維素酶(1∶100)在45 ℃水浴45 min，然后超聲20 min，取出后用50 mL離心管定容。4 ℃離心10 min，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，樣液過(guò)0.45 μm有機(jī)系濾膜，裝入進(jìn)樣瓶，備用待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別把裝有1.0 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10 μg/mL，15 μg/mL，20 μg/mL濃度系列標(biāo)準(zhǔn)液的樣品瓶放入自動(dòng)進(jìn)樣器，設(shè)置進(jìn)樣量為10 μL.峰面積為橫坐標(biāo)(X)，濃度為縱坐標(biāo)(Y)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1.

圖1 環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可以看出，環(huán)磷酸腺苷在10.0 μg/mL～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度和檢測(cè)峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為y=0.000 317 88x+0.254 771 30，相關(guān)系數(shù)為0.999 148 04.

2.2 分離度

研究發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)色譜條件下分析環(huán)磷酸腺苷保留時(shí)間是5.86 min，和cAMP標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)比，確定測(cè)定樣品含環(huán)磷酸腺苷。

環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、樣品HPLC譜圖見圖2，圖3.

圖2 環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

圖3 環(huán)磷酸腺苷樣品HPLC譜圖

2.3 不同品種不同生長(zhǎng)時(shí)期環(huán)磷酸腺苷含量

不同品種不同生長(zhǎng)時(shí)期環(huán)磷酸腺苷含量見第15頁(yè)圖4.

由圖4可以看出，不同品種不同生長(zhǎng)時(shí)期鮮棗中cAMP含量差異較大。其中，木棗各時(shí)期cAMP含量均高于板棗和壺瓶棗。木棗在白熟期含量最高，可達(dá)到580.9 μg/g；板棗和壺瓶棗中cAMP含量相對(duì)較低，分別為135.83 μg/g和129.92 μg/g.

圖4 不同品種不同生長(zhǎng)時(shí)期環(huán)磷酸腺苷含量

3 結(jié)論

1) 從3個(gè)品種鮮棗中cAMP含量分析結(jié)果來(lái)看，不同品種不同生長(zhǎng)期cAMP含量不同。其中，木棗含量最高，達(dá)到580.9 μg/g，尤其是白熟期含量較其它生長(zhǎng)期更高。隨著棗果的成熟，其cAMP含量呈下降趨勢(shì)。

2) 木棗白熟期cAMP含量最高，是板棗和壺瓶棗含量的4倍左右；木棗白熟期cAMP含量是半紅期的4倍左右，是全紅期的9倍左右。

3) 本研究為不同地域棗果cAMP含量研究提供了理論依據(jù)，下一步可對(duì)不同地域環(huán)境不同時(shí)期棗果中cAMP含量進(jìn)行深度研究。