基于SSR標(biāo)記的朝天椒種質(zhì)遺傳多樣性分析

張 曼，任佳佳，王 欽，安朝龍，吳培云，謝龍安，李 偉

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

辣椒(CapsicumannuumL.)別名番椒、海椒、秦椒，起源于墨西哥、中南美洲的熱帶地區(qū)[1]。辣椒不僅是人們喜愛的蔬菜，還可作為新型綠色藥品加以利用，栽培規(guī)模日益擴(kuò)大，是我國僅次于大白菜的第二大蔬菜作物,辣椒營養(yǎng)豐富，含有大量的辣椒素、辣椒紅素、胡蘿卜素、碳水化合物、礦物質(zhì)等，尤其是維生素C(Vc)含量更是高居各類蔬菜的榜首[2-3]。朝天椒(CapsicumfrutescensL.)是辣椒的一個(gè)變種，為茄科(Solanaceae)辣椒屬(CapsicumL.)植物，椒果小、簇生且朝天,辣度高、易干制，既可鮮食、泡制，又可作為干辣椒利用，與羊角椒、線椒構(gòu)成我國三大干椒品種系列。朝天椒的栽培面積逐年上升，已躍居干椒栽培面積首位[4-5]。

鑒定朝天椒試驗(yàn)材料的遺傳多樣性，全面了解這些品種的遺傳基礎(chǔ)和親緣關(guān)系，對(duì)發(fā)掘利用優(yōu)異的育種材料，拓寬遺傳基礎(chǔ)，加快朝天椒育種改良進(jìn)程具有重要意義。對(duì)于種質(zhì)材料遺傳多樣性的研究，表型性狀極易受環(huán)境因素影響而變化，僅依靠表型性狀難以準(zhǔn)確反映不同材料間的遺傳差異和親緣關(guān)系，基于分子水平的親緣關(guān)系較基于系譜的親緣關(guān)系具有更高的可靠性[6]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于辣椒遺傳多樣性研究中[7-13]。SSR(簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列)具有高分辨率、高穩(wěn)定性、重復(fù)性好、共顯性遺傳和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[14]，已在辣椒的遺傳多樣性分析中得到了廣泛應(yīng)用[15-20]。但是，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行朝天椒遺傳多樣性的分析較少，蔣向輝等[21]和賀潔等[22]均分析了朝天椒的遺傳多樣性，但分析材料較少；曾紹貴等[23]采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SRAP(序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)分子標(biāo)記相結(jié)合的方法對(duì)100份朝天椒品種進(jìn)行遺傳多樣性分析；詹永發(fā)等[24]采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析了156份朝天椒遺傳多樣性。目前，尚未見關(guān)于采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析大批量的朝天椒遺傳多樣性研究。因此，以西南地區(qū)朝天椒地方種質(zhì)為研究材料，從分子水平進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確它們之間的遺傳關(guān)系，為朝天椒后續(xù)育種親本選擇、種質(zhì)資源有效利用及種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料主要為西南地區(qū)的朝天椒地方種質(zhì)，共計(jì)112份(表1)，主要來源于貴州、四川、云南、重慶。其中，貴州省內(nèi)收集的朝天椒地方種95份，其他包括四川省4份，云南省5份，重慶市8份。

表1 朝天椒參試材料Tab.1 Capsicum frutescens varieties

續(xù)表1 朝天椒參試材料Tab.1(Continued) Capsicum frutescens varieties

1.2 DNA提取及引物選擇

每份材料隨機(jī)選取20個(gè)單株中的幼嫩葉片，混勻后用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，所提取的DNA使用核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度，加TE緩沖液稀釋到50 ng/μL，用于PCR反應(yīng)。利用中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2475—2013)和貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)(DB/T 953—2014)推薦的SSR核心引物，在前人研究[25-28]的基礎(chǔ)上挑選出124對(duì)引物，隨機(jī)選用24份朝天椒種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，最終篩選出20對(duì)條帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的SSR引物用于后續(xù)的遺傳多樣性分析(表2)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 SSR引物序列Tab.2 Sequence of SSR primers

1.3 PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序

PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括50 ng/μL模板DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL，2×TaqMaster mix 10 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃(根據(jù)引物退火溫度改變)退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存待測(cè)。

1.4 電泳與銀染顯色

使用DYY-6C型電泳儀，取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳液為1×TBE，恒定電壓150 V，電泳時(shí)間2～4 h。電泳結(jié)束后，將膠浸入固定液(10%乙醇和5%冰醋酸)中在搖床上固定10 min，用蒸餾水洗2遍；然后用 AgNO3染色10 min，再用蒸餾水漂洗2次；最后用顯色液(200 mL顯色液包含3 g NaOH、1 mL甲醛)顯色至條帶清晰，用蒸餾水洗脫3次停顯。最后置于白熾燈箱上照相、記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將得到的擴(kuò)增圖片以清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶進(jìn)行SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)SSR標(biāo)記統(tǒng)計(jì)的A、B、C等數(shù)據(jù)結(jié)果，用POPGENE 32軟件對(duì)不同類群的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和Shannon’s信息指數(shù)(I)等進(jìn)行遺傳多樣性數(shù)據(jù)計(jì)算和對(duì)比分析，根據(jù)SMITH等[29]的方法計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量指數(shù)(PIC)，根據(jù)SSR標(biāo)記統(tǒng)計(jì)的0、1數(shù)據(jù)結(jié)果，利用NTSYS-pc 2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)，采用類平均法進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果

利用隨機(jī)選擇的24份朝天椒材料對(duì)124對(duì)SSR引物進(jìn)行引物擴(kuò)增多態(tài)性篩選，篩選出20對(duì)擴(kuò)增效果好、條帶差異明顯的SSR引物，用于112份朝天椒材料的遺傳多樣性分析,圖1為引物19的部分?jǐn)U增結(jié)果。利用篩選出的20對(duì)引物共檢測(cè)出65個(gè)等位變異(表3)，每對(duì)引物的等位變異為2～4個(gè)，平均每對(duì)引物3.25個(gè)等位變異， 20對(duì)引物的有效等位基因數(shù)為1.311 9～2.834 5，平均為1.829 4。引物2、5、8、10、11、12、10擴(kuò)增出的等位變異最多，均為4個(gè)，其有效等位基因數(shù)分別為1.736 1、2.004 0、2.834 5、1.743 3、1.724 1、1.850 8、1.621 8。各引物的PIC值為0.324 1～0.696 0，平均為0.544 0，20對(duì)引物中有16對(duì)引物PIC值均大于0.5，其中8號(hào)引物PIC值最大，為0.696 0。

圖1 19號(hào)引物對(duì)部分朝天椒材料SSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SSR amplification results of some Capsicum frutescens materials by primer 19

表3 20對(duì)SSR引物的遺傳參數(shù)Tab.3 Genetic parameters from the 20 polymorphic SSR markers

續(xù)表3 20對(duì)SSR引物測(cè)定的遺傳參數(shù)Tab.3(Continued) Genetic parameters from the 20 polymorphic SSR markers

2.2 SSR引物的遺傳多樣性分析

基于SSR數(shù)據(jù)居群間的Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.443 5～1.108 0，平均為0.723 4，Shannon’s信息指數(shù)最大的位點(diǎn)是引物8，最小的為引物17；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.196 4(引物1)～0.901 8(引物16)，平均值為0.492 0；期望雜合度(He)為0.238 8(引物1)～0.650 1(引物8)，平均值為0.433 7；Nei’s期望雜合度為0.237 7(引物1)～0.647 2(引物8)。以上結(jié)果表明，所篩選出的20對(duì)SSR引物多態(tài)性較高，能較好地反映朝天椒不同材料間的遺傳多樣性信息。

2.3 朝天椒種質(zhì)間的遺傳相似性分析

根據(jù)20對(duì)SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)生的65個(gè)等位變異，計(jì)算了112個(gè)朝天椒種質(zhì)居群間的GS值。結(jié)果表明，供試材料居群間GS值為0.569 2～0.953 8，平均值為0.773 3，說明朝天椒種質(zhì)間的遺傳相似性相對(duì)較高，材料間的親緣關(guān)系非常接近。7號(hào)材料和8號(hào)材料、22號(hào)材料和23號(hào)材料GS值最大(7號(hào)和8號(hào)材料均來自貴州息烽縣，22號(hào)和23號(hào)材料均來自紅花崗區(qū))，表明這幾個(gè)朝天椒居群間的遺傳距離最近，遺傳相似度最大，說明親緣關(guān)系越近，遺傳相似性越高；4號(hào)材料和86號(hào)材料GS值最小(4號(hào)材料來自息烽縣，86號(hào)材料來自臺(tái)江縣)，表明這2個(gè)材料間遺傳相似性很小，它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 朝天椒種質(zhì)的SSR聚類分析

以SSR分子標(biāo)記在112個(gè)材料間多態(tài)性數(shù)據(jù)計(jì)算GS值，采用類平均法(UPGMA)聚類分析(圖2)，結(jié)果表明，在閾值0.767處將供試材料分為4類，第1類包含55份材料，55份材料中貴州省內(nèi)的共47份，分別來自開陽縣(2份)、息烽縣(7份)、桐梓縣(2份)、遵義縣(4份)、紅花崗區(qū)(1份)、綏陽縣(1份)、道真縣(1份)、務(wù)川縣(1份)、平壩縣(1份)、羅甸縣(3份)、六枝特區(qū)(1份)、玉屏縣(4份)、沿河縣(1份)、思南縣(1份)、大方縣(4份)、黎平縣(2份)、臺(tái)江縣(9份)、開陽縣(1份)、福泉市(1份)，四川省2份，重慶市6份，其中來自玉屏縣(57號(hào)和58號(hào))、福泉市(95號(hào))和四川省(98號(hào))的材料與其他51份材料的遺傳距離較遠(yuǎn)；第2類只包含1份材料，來自興義市，說明該材料與其他材料間遺傳差異較大，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；第3類包含14份材料，來自貴州省的有11份，分別來自遵義縣(1份)、沿河縣(5份)、思南縣(2份)、臺(tái)江縣(3份)，四川省1份，云南省1份，重慶市1份；第4類包含42份，來自貴州省的有36份，分別來自桐梓縣(4份)、遵義縣(1份)、紅花崗區(qū)(2份)、綏陽縣(2份)、道真縣(1份)、務(wù)川縣(2份)、三都縣(4份)、貴定縣(3份)、盤縣(1份)、六枝特區(qū)(5份)、興仁縣(4份)、沿河縣(2份)、大方縣(4份)、黎平縣(1份)，四川省1份，云南省4份，重慶市1份，其中來自六枝特區(qū)(4份)和四川省(97號(hào))的材料與其他37份材料的遺傳距離較遠(yuǎn)。112份朝天椒材料中，整體分布與地理分布有一定關(guān)聯(lián)，但也存在區(qū)域間和省內(nèi)外間的互相滲透，每個(gè)類別均聚集了不同地理來源的材料。

圖2 112份朝天椒種質(zhì)資源聚類分析

3 結(jié)論與討論

本研究從124對(duì)引物中篩選出20對(duì)SSR標(biāo)記，對(duì)西南地區(qū)的朝天椒地方種質(zhì)，共計(jì)112份進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均每個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出3.25個(gè)等位變異。陳文超等[30]利用33個(gè)EST-SSR標(biāo)記分析了31份辣椒種質(zhì)的遺傳多樣性，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出2.76個(gè)等位基因。李艷等[31]利用17對(duì)SSR引物對(duì)169份辣椒材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.71個(gè)位點(diǎn)。賈豪等[19]利用41對(duì)SSR引物分析了24份辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出5.15個(gè)位點(diǎn)。傅鴻妃等[20]利用31對(duì)SSR引物對(duì)52份辣椒種質(zhì)材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析，平均檢測(cè)到6.613個(gè)等位位點(diǎn)。本研究中SSR位點(diǎn)檢測(cè)到的平均等位基因數(shù)量高于陳文超等[30]和李艷等[31]的結(jié)果，卻低于賈豪等[19]和傅鴻妃等[20]的結(jié)果。表明本研究所篩選出的SSR引物可以反映出種質(zhì)之間的遺傳多樣性，只是引物多態(tài)性信息不夠豐富，其原因可能是由于朝天椒為辣椒變種，為辣椒種下的一個(gè)亞種，而所選引物均是研究辣椒遺傳多樣性的，還有原因可能是所選112份材料絕大多數(shù)來自于貴州本地，其親緣關(guān)系較近。按照BOTSTEIN等[32]提出的衡量指標(biāo)，當(dāng)PIC值>0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)，本試驗(yàn)中的平均PIC值為0.544 0，20對(duì)引物中有16對(duì)引物PIC值均>0.5，表明這些位點(diǎn)較好地反映了朝天椒材料的遺傳多樣性，適合應(yīng)用于朝天椒材料的遺傳多樣性檢測(cè)。

SSR聚類分析表明，供試材料中的平均遺傳相似系數(shù)是0.773 3，說明朝天椒品種間的遺傳相似性相對(duì)較高，材料間的親緣關(guān)系比較接近，說明大部分材料親緣關(guān)系較近，需要努力拓寬品種選育的遺傳基礎(chǔ),112份朝天椒材料類群劃分結(jié)果與品種的地理來源有一定關(guān)聯(lián)，但群體遺傳分化不明顯，群體間的遺傳關(guān)系較近，且不同群體間材料存在著互相滲透，可能原因是所選擇的群體范圍比較窄，或者選擇群體不夠大。本研究利用20對(duì)SSR標(biāo)記分析了112份朝天椒的遺傳多樣性，將112份材料分成了4類，為朝天椒地方種資源間親緣關(guān)系的揭示、資源保存和新品種選育提供了參考依據(jù)。