近暗散白蟻β-葡萄糖苷酶RpBgl7的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

毛國濤，劉 茜，王方園，蘇麗娟，張宏森，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)可降解非還原性末端的β-葡萄糖苷鍵，生成出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的糖基配體，在纖維素的高效降解過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。β-葡萄糖苷酶可降解纖維二糖和纖維寡糖，緩解內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的產(chǎn)物抑制，是纖維素降解過程的限速酶[1]。β-葡萄糖苷酶大部分屬于糖苷水解酶1(GH1)家族和GH3家族，少數(shù)屬于GH5、9、30和116家族[2-5]。GH1家族β-葡萄糖苷酶具有8個(ɑ/β)結(jié)構(gòu)圍成的(ɑ/β)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)，也被稱為4/7超家族，活性中心位于TIM桶狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，2個保守的谷氨酸殘基作為催化基團(tuán)催化β-葡萄糖苷鍵的水解[6-7]；GH3家族β-葡萄糖苷酶大多數(shù)由(ɑ/β)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)域、(α/β)6夾層結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域組成，其催化殘基由保守的天冬氨酸和谷氨酸組成[8-9]。GH1和GH3家族成員均采用雙取代“兩步法”構(gòu)型保持機(jī)制催化底物的水解。研究顯示，GH1家族β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性遠(yuǎn)高于GH3家族，表明GH1家族成員在纖維素的徹底、高效降解中更具優(yōu)勢。

白蟻腸道內(nèi)高效的木質(zhì)纖維素降解酶系，是自然界降解木質(zhì)纖維素能力最強(qiáng)的生物系統(tǒng)之一[10]。因此，白蟻逐漸成為挖掘具有活力高、葡萄糖耐受性高、熱穩(wěn)定性良好等優(yōu)異特性纖維素酶的重要來源[11]。白蟻的纖維素酶系主要由其自身和腸道共生微生物共同產(chǎn)生[12-13]，如黃翅大白蟻(Macrotermesbarneyi)內(nèi)源性GH1家族β-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的葡萄糖耐受性[14]；高山象白蟻(Nasutitermestakasagoensis)內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶具有較好的溫度穩(wěn)定性[15]。在前期研究中，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)宋安東課題組從近暗散白蟻(Reticulitermesperilucifugus)中克隆了GH1家族β-葡萄糖苷酶基因RpBgl7[16]。本研究在大腸桿菌中進(jìn)行過量表達(dá)RpBgl7，利用鎳離子親和層析法純化得到高純度的RpBgl7蛋白，研究RpBgl7的最適pH值、最適溫度等酶學(xué)性質(zhì)，為構(gòu)建秸稈生物質(zhì)高效降解酶系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pCold-TF冷休克表達(dá)載體、重組RpBgl7基因的pEASY-Blunt Simple-RpBgl7載體、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)能源微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

酵母提取物、胰蛋白胨購于英國OXID公司，分析純；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)購自美國Sigma公司，分析純；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、咪唑均購于索萊寶(北京)科技有限公司，分析純；30%聚丙酰胺購于北京康潤誠業(yè)生物科技公司，分析純；鎳離子親和介質(zhì)購于德國Qiagen公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購于北京莊盟生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購于美國Thermo Fisher Scientific公司；限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XbaⅠ購于美國NEB公司。

1.3 方法

1.3.1 RpBgl7的生物信息學(xué)分析 利用Expasy軟件包中ProParam預(yù)測RpBgl7的基本性質(zhì)[17]；使用Clustal Omega對RpBgl7與已深入研究的GH1家族β-葡萄糖苷酶進(jìn)行序列比對[18]；利用PHYRE2預(yù)測RpBgl7的結(jié)構(gòu)模型[19]。

1.3.2 重組載體pCold-TF-RpBgl7的構(gòu)建 以正向引物5’-CGAGCTCATGGGGAGTGATAATTGGGCCACAG-3’、反向引物5’-GCTCTAGACTAAGAACTCTCGACACCCAGAAATTCTAC-3’為PCR擴(kuò)增引物(下劃線序列分別為SacⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn))，以pEASY-Blunt Simple-RpBgl7為PCR擴(kuò)增模板，擴(kuò)增RpBgl7基因。限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ同時酶切后的RpBgl7基因片段與pCold-TF載體片段，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCold-TF-RpBgl7，測序驗(yàn)證RpBgl7基因序列。

1.3.3 RpBgl7的重組表達(dá)及純化 重組表達(dá)載體pCold-TF-RpBgl7轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.8時，加入0.5 mmol/L的IPTG于16 ℃振蕩培養(yǎng)18 h。收集菌體，裂解緩沖液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.4)重懸菌體，超聲破碎，16 000g離心30 min后取上清流穿鎳離子親和層析柱，洗雜緩沖液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，80 mmol/L咪唑，pH值7.4)流穿鎳離子親和層析柱，洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，200 mmol/L咪唑，pH值7.4)流穿鎳離子親和層析柱洗脫RpBgl7蛋白，利用超濾管(美國Millipore公司)進(jìn)行脫鹽濃縮，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析RpBgl7純度，高純度RpBgl7蛋白分裝凍存于-80 ℃。

1.3.4 RpBgl7酶活力的測定 采用pNPG法對RpBgl7的酶活力進(jìn)行測定?？傮w積為200 μL的反應(yīng)體系中含有20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.0)、5 mmol/L的pNPG和適當(dāng)稀釋的RpBgl7酶液，于37 ℃反應(yīng)10 min后加入50 μL的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)測定其在408 nm 波長處的吸光值，以不同含量對硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算RpBgl7的酶活力。1 min內(nèi)催化pNPG底物生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.5 RpBgl7最適pH值的測定 以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH值3.0～5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH值6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH值8.0～9.0)、碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH值10.0～11.0)為測定酶活力時的緩沖液，按照1.3.4方法于37 ℃測定RpBgl7的酶活力。以得到的最高酶活力處pH值為RpBgl7的最適pH值。

1.3.6 RpBgl7最適溫度及穩(wěn)定性的測定 以RpBgl7的最適pH值緩沖液為酶活力測定緩沖液，分別在30～90 ℃條件下，測定RpBgl7的酶活力。以得到最高酶活力處的溫度為RpBgl7的最適溫度。稀釋的酶液分別在40～80 ℃下孵育30 min，最適反應(yīng)條件下測定RpBgl7的殘余酶活力，以未孵育酶液測定的酶活力為100%。

1.3.8 RpBgl7動力學(xué)參數(shù)的測定 于37 ℃測定RpBgl7在0.2～2.0 mmol/L pNPG底物條件下的酶促反應(yīng)速率，根據(jù)米氏方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算RpBgl7的動力學(xué)參數(shù)Km和kcat。

2 結(jié)果與分析

2.1 RpBgl7的生物信息學(xué)分析

RpBgl7具有494個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為56.7 ku，理論等電點(diǎn)pI=5，不穩(wěn)定系數(shù)為38.4，表明RpBgl7較穩(wěn)定，適合進(jìn)行表達(dá)、純化。RpBgl7與已解析結(jié)構(gòu)的GH1家族β-葡萄糖苷酶G1NKBG(Uniprot：O61594，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB：3ai0)、Sfβgly(Uniprot：O61594，PDB：5cg0)具有較高的序列相似性(分別為55%、46%)，含有家族內(nèi)保守的催化氨基酸殘基Glu187和Glu394(圖1)。RpBgl7的結(jié)構(gòu)模型顯示，RpBgl7同樣由GH1家族保守的(ɑ/β)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)域組成(圖2)。生物信息學(xué)分析表明，RpBgl7極可能采用GH1家族β-葡萄糖苷酶的催化機(jī)制催化纖維二糖等底物的水解。

保守殘基標(biāo)記為紅色，催化殘基標(biāo)記為黃色

圖2 RpBgl7蛋白的結(jié)構(gòu)模型

2.2 重組載體pCold-TF-RpBgl7的構(gòu)建

擴(kuò)增得到的RpBgl7基因特異性條帶大小與理論分子質(zhì)量相符(圖3A)。酶切后與載體片段重組為pCold-TF-RpBgl7(圖4)，RpBgl7基因序列經(jīng)測序驗(yàn)證與理論序列一致。

2.3 RpBgl7的重組表達(dá)與純化

質(zhì)粒pCold-TF-RpBgl7所表達(dá)的RpBgl7重組蛋白的N端融合了觸發(fā)因子(TF，分子質(zhì)量為48 ku)，該因子作為分子伴侶，有助于重組蛋白的折疊；RpBgl7重組蛋白的N末端帶有組氨酸(6×His)標(biāo)簽。RpBgl7蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化后，SDS-PAGE顯示100～150 ku之間有一條明顯的蛋白條帶，與重組蛋白的理論分子質(zhì)量105 ku相符(圖5)。結(jié)果表明，RpBgl7重組蛋白經(jīng)鎳離子親和層析1步純化后純度即可達(dá)到90%以上，可用于后續(xù)酶活性分析。

A：RpBgl7基因的擴(kuò)增；B：酶切后的pCold-TF片段和RpBgl7基因片段；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1：RpBgl7基因擴(kuò)增片段；2：未酶切的pCold-TF；3—4：酶切后的pCold-TF；5—6：酶切后的RpBgl7基因

圖4 pCold-TF-RpBgl7表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1：細(xì)胞裂解后上清部分；2：細(xì)胞裂解后沉淀部分；3：純化后的RpBgl7蛋白

2.4 RpBgl7的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 RpBgl7的最適pH值和最適溫度 以pNPG為底物，測定RpBgl7的最適條件。結(jié)果表明，RpBgl7的最適pH值為6.0，在pH值4.0～7.0內(nèi)具有較高的酶活力；最適溫度為70 ℃(圖6)。RpBgl7在最適條件下的比活力為0.05 U/mg。

圖6 RpBgl7的最適pH值和最適溫度

圖7 不同金屬離子對RpBgl7酶活力的影響

2.4.3 RpBgl7的動力學(xué)參數(shù) 以pNPG為底物，在37 ℃條件下測定RpBgl7蛋白的動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示，Km=0.13 mmol/L，kcat=3.15 s-1(圖8)。

圖8 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法測定的RpBgl7動力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論與討論

我國每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物約為10億t，其中所含纖維素約為30%～40%[20]，纖維素是生物界中最豐富的葡萄糖分子聚合物之一，也是秸稈生物質(zhì)的主要組成部分。纖維素可用來生產(chǎn)燃料乙醇等替代化石燃料，以解決能源危機(jī)的可再生生物質(zhì)資源，也逐漸成為合成環(huán)境友好型以及具有良好生物相容性的高附加值產(chǎn)品的重要原材料[21]。纖維素的高效利用依賴于其充分的降解，纖維素的降解主要由內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等的相互協(xié)同作用[22-23]。研究表明，作為纖維素降解過程中的限速酶，β-葡萄糖苷酶存在著活力較低、穩(wěn)定性較差、葡萄糖耐受性較弱等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約著纖維素的高效、充分降解[24]。因此，優(yōu)異特性β-葡萄糖苷酶的挖掘?qū)τ诶w維素的高效利用至關(guān)重要。