基因工程表達(dá)雞IFN-λ抗Ⅰ群禽腺病毒感染

許鑫燕，王延龍，楊 倩，吳艷濤，2，張小榮，2*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

近年來(lái)，由Ⅰ群禽腺病毒感染引起的心包積水-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵體肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。其中HHS主要由FAdV-4引起，而IBH則主要由FAdV-8b引起[1]。Ⅲ型干擾素(IFN)又稱為IFN-λ，是2003年發(fā)現(xiàn)的一種新型IFN家族，具有與Ⅰ，Ⅱ型IFN類似的抗病毒特性，但利用不同的配體-受體系統(tǒng)，主要在一些上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞上發(fā)揮作用[2]。本研究旨在評(píng)價(jià)應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的基因工程chIFN-λ對(duì)Ⅰ群禽腺病毒的感染抗病毒效果，以期為禽Ⅰ群腺病毒感染的防控開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞表達(dá)chIFN-λ的重組桿狀病毒AcMNPV-chIFN-λ[3]、FAdV-4 GX2013株、FAdV-8b QD2016株[4]、水泡性口炎病毒、Sf9草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑Sf900 Ⅱ SFM培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司;Lonsera特級(jí)胎牛血清購(gòu)自上海雙洳生物科技有限公司；其他各類分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞肝癌細(xì)胞系LMH購(gòu)自ATCC(CRL-2118)；SPF雞購(gòu)自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司。

1.4 chIFN-λ在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與純化將液氮凍存的Sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用Sf-900TMⅡ SFM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)繁。將擴(kuò)繁到足夠數(shù)量的細(xì)胞用含1% FCS的Sf-900TMII SFM培養(yǎng)液重懸至2×106細(xì)胞/mL的濃度，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在27℃培養(yǎng)箱放置1 h待細(xì)胞完全貼壁后，按照MOI = 1的比例接種重組桿狀病毒AcMNPV-chIFN-λ，27℃繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后，首先收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液，然后向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)上清液1/10體積的PBS(pH7.4)，收獲細(xì)胞，超聲波裂解細(xì)胞，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，并將之前收集到的上清液合并，所得即為重組chIFN-λ表達(dá)產(chǎn)物，小量分裝后―70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組chIFN-λ抗病毒效價(jià)測(cè)定利用LMH/VSV微量病變抑制法檢測(cè)制備的重組chIFN-λ的抗病毒效價(jià)[3]。具體方法為：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種LMH細(xì)胞至90%匯合度，將重組chIFN-λ表達(dá)產(chǎn)物以10倍梯度稀釋，100 μL/孔加入96孔板中致敏LMH細(xì)胞，每個(gè)稀釋度做5個(gè)重復(fù)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄上清液，每孔加入100 TCID50/100 μL VSV病毒液，24～48 h后觀察細(xì)胞病變。將抑制50%細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)孔的IFN最高稀釋度定為1個(gè)IFN活性單位(U)。

1.6 重組chIFN-λ對(duì)禽Ⅰ群腺病毒的抗病毒作用評(píng)價(jià)

1.6.1體外抗病毒作用評(píng)價(jià) 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種LMH細(xì)胞至90%匯合度，將重組chIFN-λ表達(dá)產(chǎn)物以10倍梯度稀釋，100 μL/孔加入96孔板中致敏LMH細(xì)胞，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，棄上清液，每孔加入100 TCID50/100 μL的FAdV-4 GX2013株或FAdV-8b QD-2016株病毒液，24～48 h后觀察細(xì)胞病變。將抑制50% CPE出現(xiàn)孔的IFN最高稀釋度定為1個(gè)IFN活性單位(U)。

1.6.2體內(nèi)抗病毒作用評(píng)價(jià) 對(duì)FAdV-4的體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)：15只1月齡SPF雞平均分為3組，每組5只。第1組為攻毒治療組，首先按照2×106/只的劑量在左側(cè)胸部肌肉注射重組chIFN-λ，6 h后在右側(cè)胸部肌肉注射FAdV-4 GX2013株(105.5TCID50/mL，0.2 mL/只)，以后每日用同樣劑量的重組chIFN-λ進(jìn)行胸部肌肉注射；第2組相同的方式進(jìn)行攻毒，但不注射重組chIFN-λ進(jìn)行治療；第3組為健康對(duì)照組，不做任何處理。每日觀察和記錄各組試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況，于攻毒后5 d撲殺所有未死亡雞。對(duì)FAdV-8b的體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)：試驗(yàn)分組同上，攻毒毒株為FAdV-8b QD2016株(105.5TCID50/mL，0.2 mL/只)。每日觀察和記錄各組試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況，于攻毒后5 d撲殺所有未死亡雞，同時(shí)采集試驗(yàn)雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子，處理后提取DNA，應(yīng)用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定病毒含量，對(duì)試驗(yàn)雞的排毒情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組chIFN-λ表達(dá)產(chǎn)物的效價(jià)測(cè)定用重組桿狀病毒AcMNPV-chIFN-λ感染Sf9細(xì)胞，72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解上清，混合獲得粗制重組chIFN-λ。通過VSV細(xì)胞病變抑制法測(cè)定，重組chIFN-λ表達(dá)產(chǎn)物在LMH細(xì)胞上的抗病毒效價(jià)為3.16×106U/mL。

2.2 重組chIFN-λ對(duì)禽Ⅰ群腺病毒的體外抗病毒作用通過細(xì)胞病變抑制法分別測(cè)定重組chIFN-λ對(duì)FAdV-4 GX2013株、FAdV-8b QD-2016株的抑制作用，結(jié)果顯示，重組chIFN-λ在LMH細(xì)胞上的抑制效價(jià)分別為1.33 ×106，1.78 ×106U/mL。

2.3 重組chIFN-λ對(duì)禽Ⅰ群腺病毒的抗病毒作用

2.3.1對(duì)FAdV-4的體內(nèi)抗病毒作用 健康對(duì)照組試驗(yàn)雞在攻毒后5 d內(nèi)未出現(xiàn)任何臨床癥狀。攻毒對(duì)照組試驗(yàn)雞在攻毒后3 d內(nèi)全部死亡。重組chIFN-λ治療組試驗(yàn)雞攻毒后5 d存活率為60%，死亡雞的死亡時(shí)間相對(duì)于攻毒對(duì)照組也有所推遲。各組攻毒后生存曲線見圖1。

圖1 FAdV-4攻毒后各試驗(yàn)組生存曲線圖

2.3.2對(duì)FAdV-8b的體內(nèi)抗病毒作用 FAdV-8b攻毒后各試驗(yàn)組均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀和死亡。攻毒后5 d分別采集各組試驗(yàn)雞只的咽喉拭子和泄殖腔拭子，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行排毒情況監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示與攻毒對(duì)照組相比，重組chIFN-λ治療組試驗(yàn)雞經(jīng)呼吸道和消化道排毒的量均顯著降低(圖2)，存在極顯著差異(P<0.01)。

圖2 FAdV-8b攻毒后第5天排毒檢測(cè)結(jié)果 A.呼吸道排毒；B.消化道排毒

3 討論

研究表明，chIFN-λ其具有抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等作用。有實(shí)驗(yàn)證明，chIFN-λ可以有效誘導(dǎo)黏膜上皮內(nèi)的肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的分化增殖，增強(qiáng)非特異性免疫功能，對(duì)以上皮細(xì)胞為感染對(duì)象的病毒有較好的抗病毒效果[5-6]。

前期研究已經(jīng)證明Ⅲ型IFN在人的肝炎治療中發(fā)揮著一定作用[7-9]。禽Ⅰ群腺病毒感染途徑主要是消化道和呼吸道，可引起感染雞的肝臟發(fā)生特征性病變[10-14]，因此推測(cè)chIFN-λ可能對(duì)禽Ⅰ群腺病毒感染也會(huì)有較好的抗病毒治療效果。

從本研究的結(jié)果看，chIFN-λ確實(shí)對(duì)禽Ⅰ群腺病毒感染有顯著的抑制作用。在研究中由于FAdV-4肌肉注射攻毒是致死的[15]，所以以治療后的存活率作為治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，因?yàn)楣ザ緦?duì)照組試驗(yàn)雞在攻毒后3 d內(nèi)全部死亡，所以未進(jìn)行排毒檢測(cè)；而FAdV-8b在人工感染試驗(yàn)中通常不引起死亡，甚至在實(shí)驗(yàn)室條件下也無(wú)法復(fù)制模擬出典型的臨床表現(xiàn)，但感染雞可通過呼吸道和消化道途徑大量排毒[15]，因此在本研究中以攻毒后5 d的排毒情況作為治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

在本研究中，重組chIFN-λ的制備是利用表達(dá)chIFN-λ重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)后所收獲的粗制產(chǎn)物，考慮到成本因素，并未進(jìn)行進(jìn)一步精制純化，可能會(huì)對(duì)結(jié)果存在一定的影響，在下一步的研究中還需要進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化。為進(jìn)一步降低在大規(guī)模臨床應(yīng)用條件下的成本，進(jìn)一步探索利用高密度發(fā)酵技術(shù)提高重組chIFN-λ的表達(dá)量也是下一步需要重點(diǎn)研究的課題之一。