HPLC-DAD法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的方法

伍濤，肖裕章，李成洪，鄧余，唐達(dá)，陳誠，唐紅梅

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶 402460)

益母草(Leonurusjaponicus)又名茺蔚[1]，近年來在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛[2-3]，其有效活性成分主要是鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿[4-5].鹽酸益母草堿主要用于婦科和心血管系統(tǒng)疾病治療[6]，而鹽酸水蘇堿具有抗氧化、延緩心力衰竭、利尿消腫、收縮子宮、抗炎等功效，在獸醫(yī)臨床上常用于輔助母豬產(chǎn)后消炎[7-9].因此，將鹽酸水蘇堿作為益母草顆粒的檢測指標(biāo)具有一定科學(xué)依據(jù)[10-11].

目前，益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量測定主要有薄層色譜掃描法[12]、紫外分光光度法[13]、高效液相色譜法[14-16]、HPCE法[17]和TLCS法[18]，以及延伸的LC-MS法和LC-QDA法[19-20].薄層掃描法耗時(shí)、過程繁瑣且結(jié)果較粗略，其他方法儀器檢測成本和維護(hù)費(fèi)用高，操作較復(fù)雜，不利于推廣應(yīng)用.高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法具有操作簡單、易于普及和加樣回收率高的特點(diǎn)[21]，與普通紫外檢測器比較，具有更高的準(zhǔn)確性，且全波段掃描的結(jié)果更為直觀，所得色譜分離度好，重復(fù)性高，精密度好，可以用作益母草顆粒質(zhì)量評價(jià)中鹽酸水蘇堿含量的測定，同時(shí)也為該類中藥制劑檢測提供了新的思路.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽酸水蘇堿對照品(批號：110712-201614，含量100%)購自中國食品藥品檢定研究院；益母草藥材和益母草顆粒購自中國(榮昌)畜牧產(chǎn)品交易市場；乙腈，色譜級，購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸、乙醇和乙腈，分析純，購于重慶川東化工(集團(tuán))有限公司.

安捷倫1260高效液相色譜儀：四元泵VL：G7129A；DAD檢測器：G7115A；自動(dòng)進(jìn)樣器：G7111A；LC1260色譜工作站；SB-5200DTD 超聲波清洗機(jī)購于寧波新芝生物科技股份有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，加入70%乙醇溶液使其溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液.

1.2.2 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液.

1.2.3 供試品溶液的制備取研細(xì)后的益母草顆粒0.5 g(或益母草藥材粉末約0.3 g)，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入適量的70%乙醇，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)20 min，冷卻，用70%乙醇定溶25 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液.

1.2.4 陰性供試品溶液的制備按益母草顆粒劑處方工藝制備取缺益母草的陰性顆粒劑作為陰性供試品，同供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液.

1.2.5 檢出限、定量限對照品溶液的制備精密量取鹽酸水蘇堿對照儲(chǔ)備液2 mL置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，再從中精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻.

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備精密量取鹽酸水蘇堿對照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、6.0、10.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋，定容，即得鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度分別為0.049 88、0.099 75、0.199 5、0.299 3、0.598 5、0.997 5 mg/mL的溶液.

1.2.7 專屬性試驗(yàn)取對照品、供試品和陰性供試品溶液進(jìn)行測定，記錄色譜圖.

1.2.8 檢出限、定量限取檢測限、定量限對照品溶液進(jìn)行測定，按3倍信噪比(S/N>3)為檢測限、10倍信噪比(S/N>10)為定量限計(jì)算.

1.2.9 線性范圍考察取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，記錄峰面積，以鹽酸水蘇堿峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對鹽酸水蘇堿對照品進(jìn)樣量和峰面積進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì).

1.2.10 精密度試驗(yàn)取對照品溶液進(jìn)行測定，精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄鹽酸水蘇堿的峰面積.

1.2.11 重復(fù)性試驗(yàn)取對照品溶液，并同時(shí)制備6份供試品溶液進(jìn)行測定，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，測定鹽酸水蘇堿的峰面積.

1.2.12 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)取益母草顆粒(批號：170901)樣品制備成供試品溶液進(jìn)行測定，分別于0、2、6、8、10、13 h共計(jì)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測定鹽酸水蘇堿的峰面積并統(tǒng)計(jì)結(jié)果.

1.2.13 加樣回收試驗(yàn)精密取9份已知含量的益母草顆粒樣品(批號：170901，含量5.11 mg/g)約0.5 g，分別置50 mL量瓶中，第1、2、3份精密加入對照品貯備液(1.102 1 mg/mL)8 mL，第4、5、6份精密加入10 mL，第7、8、9份精密加入12 mL，精密加入70%乙醇近刻度，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)20 min，冷卻，再加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得.以1.2.8項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測定，精密吸取對照品溶液(0.984 4 mg/mL)和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，測定鹽酸水蘇堿的峰面積，并計(jì)算含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 樣品處理方法的選擇參照2015版的《中國獸藥典》[1]和《中國藥典》[10]中益母草及益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量項(xiàng)下的樣品處理方法，分別對回流和超聲處理樣品進(jìn)行對比考察，發(fā)現(xiàn)超聲處理與回流2 h的結(jié)果無差別，但相比之下超聲處理更加簡便，且耗時(shí)短，效率更高.因此，本研究選擇超聲處理法處理樣品.

2.1.2 流動(dòng)相的選擇以乙腈和水作為流動(dòng)相，篩選出最佳比例流動(dòng)相.通過對乙腈∶水分別為80∶20、78∶22、75∶25、85∶15和90∶10不同比例分別進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈∶水為85∶15分離較差，乙腈∶水為90∶10保留時(shí)間長、峰形較差，乙腈∶水為80∶20、78∶22、75∶25均可達(dá)到較好的效果.綜合考慮，本研究選擇流動(dòng)相為乙腈∶水(80∶20).

2.1.3 色譜柱和色譜條件的選擇為確定色譜柱對鹽酸水蘇堿的分離效果，分別對Welch XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Waters X Bridge HILIC色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)3種不同色譜柱進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)C18色譜柱保留時(shí)間過長且峰形較差，氨基色譜柱和 HILIC色譜柱都能達(dá)到較好的分離，但HILIC色譜柱峰形更好，因此本研究選擇HILIC色譜柱進(jìn)行試驗(yàn).色譜條件為：Waters X Bridge HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(80∶20)；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL.

2.1.4 試驗(yàn)溫度的選擇為研究溫度對鹽酸水蘇堿含量測定的影響，分別選擇25、30、35、40 ℃進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)溫度越高保留時(shí)間越短，分離度增大.綜合考慮，本研究選擇30 ℃為試驗(yàn)溫度.

2.2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品色譜圖中出現(xiàn)的色譜峰和對照品主峰的保留時(shí)間一致，而陰性對照在此保留時(shí)間無色譜峰(圖1)，這表明益母草的陰性樣品無干擾.

2.3 檢出限、定量限試驗(yàn)結(jié)果

通過計(jì)算，檢出限結(jié)果為0.015 96 μg/mL，定量限結(jié)果為0.045 88 μg/mL.

2.4 線性范圍考察結(jié)果

回歸方程為：Y=2 646 403.256 7x+368.115 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 97.結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿含量在0.05～1.00 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖2).

圖2 鹽酸水蘇堿線性回歸圖Figure 2 Linear regression of stachydrine hydrochloride

2.5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.52%(表1)，表明本方法的精密度良好.

表1 精密度試驗(yàn)

A：鹽酸水蘇堿對照品；B：益母草藥材；C：益母草顆粒；D：益母草顆粒陰性樣品；E：空白試劑.A：Stachysite hydrochloride reference；B：Leonurus herb medicinal material；C：Leonurus granule；D：Leonurus granule negative sample；E：Blank reagent.圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖Figure 1 Chromatogram of specificity test

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

測得6份供試品溶液中鹽酸水蘇堿平均含量為5.11 mg/g，RSD為0.64%(表2)，表明本方法的重復(fù)性良好.

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果為RSD為0.71%(表3)，表明供試品溶液在13 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.8 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

對9份已知含量的益母草顆粒樣品的平均回收率為109.89%，RSD1.03%(表4)，表明本方法回收率較高.

表2 重復(fù)性試驗(yàn)的測定

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)的測定

表4 回收率的測定

3 討論

3.1 鹽酸水蘇堿結(jié)構(gòu)

鹽酸水蘇堿分子量小，不僅含有堿性基團(tuán)NH4+，還含有酸性基團(tuán)COOH-，具有很強(qiáng)的極性，在水中極易溶解，在常規(guī)的C18柱上難以有效保留[22].因此，采用常規(guī)的生物堿分析方法難以有效分離鹽酸水蘇堿.

3.2 測定條件

3.3 同類研究

近年來，許多研究者對益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的測定方法進(jìn)行了探索，主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和TLCS法，延伸的方法有LC-MS法和LC-QDA法.但這些檢測方法均具有明顯的局限性，如儀器成本高，維護(hù)費(fèi)用高，操作較復(fù)雜等，難以在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行推廣應(yīng)用.因此選擇1種快速、方便、精確的鹽酸水蘇堿含量測定方法是建立益母草顆粒質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)實(shí)需要.

3.4 國標(biāo)對比

在中國藥典2015版一部中，益母草含量項(xiàng)下測定鹽酸水蘇堿所使用的是蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法，益母草顆粒含量項(xiàng)下使用的是薄層色譜掃描法[10].而在獸藥生產(chǎn)實(shí)踐中，此類方法處理復(fù)雜耗時(shí)，薄層色譜法測定含量誤差較大.而本研究使用的HPLC-DAD法操作簡單，易于普及推廣使用，同時(shí)與普通紫外檢測器比較，更具準(zhǔn)確性，可全波段掃描，結(jié)果更直觀.此外，該方法所得色譜分離度好、重復(fù)性高、精密度好，可用于相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制，也為該中藥其他單位制劑檢測提供了新思路和新方法.

4 結(jié)論

本研究采用HPLC-DAD法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量，離度好、重復(fù)性高、精密度好，鹽酸水蘇堿可以得到更好的保留，且各項(xiàng)檢測指標(biāo)均能達(dá)到要求，同時(shí)操作簡單，利于推廣應(yīng)用，為益母草顆粒及其他單位制劑提供參考及借鑒，具有良好的開發(fā)前景.