響應(yīng)面法優(yōu)化索式提取艾草精油的工藝研究

李健鵬，李險(xiǎn)峰，陳鴻雁，肖定書

（惠州學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院/大亞灣化工研究院，廣東 惠州 516007）

艾草，又名醫(yī)草，海艾，炙草等別稱，廣泛分布于中國(guó)大部分地區(qū)、蒙古、俄羅斯、朝鮮等國(guó)家和地區(qū).艾草可以制成美味的糕點(diǎn)，例如，將艾草與糯米粉、糖等調(diào)味料混合進(jìn)行蒸煮可制成可口的艾粄，目前，有企業(yè)以艾草為綠色安全添加劑，制作成一系列的食品和配料.除了食用外，艾草在中醫(yī)上被認(rèn)為，具有溫經(jīng)、袪濕、除寒等作用，例如市面上有售的艾草腳貼、艾草醫(yī)用貼膏和精華素等.另外，實(shí)際的臨床經(jīng)驗(yàn)證明，艾草具有止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗過(guò)敏等作用.近年來(lái)，隨著人們對(duì)艾草的深入研究，發(fā)現(xiàn)艾草對(duì)人體生理功能有重要的調(diào)節(jié)作用.例如Shi等人［1］從艾草提取的水溶性多糖并研究其在體外免疫調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)，艾草的多糖可以促進(jìn)免疫球蛋白，細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及體外NO濃度的產(chǎn)生.Huang等人［2］采用艾草精油探索其抗炎和活化血瘀活性，結(jié)果表明，皮膚給藥的所有劑量的精油均可顯著降低二甲基苯誘發(fā)的耳部水腫和角叉菜膠誘發(fā)的爪水腫的腫脹，并降低冰醋酸誘發(fā)的腹腔毛細(xì)血管的通透性，具有良好的消腫性.Shi等人［3］研究表明，補(bǔ)充500 mg/kg的精油可以顯著提高小腸的過(guò)氧化氫酶活性，并且空腸的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性得到改善，表明艾草的提取物可以提高小腸的抗氧化能力.

艾草的化學(xué)成份很復(fù)雜，提取物有揮發(fā)性油、黃酮類、桉葉烷類和三菇類等化合物［4］.目前，常用的提取艾草精華液的方法主要是常規(guī)蒸餾法［5］，此方法提取率低，時(shí)間長(zhǎng)，能耗高；另外，近年來(lái)，發(fā)展起來(lái)的微波萃取技術(shù)有利縮短提取時(shí)間，并且微波功率可控，達(dá)到選擇性高的目的［6］.但是微波過(guò)程在短時(shí)間內(nèi)帶來(lái)的高功率高熱量容易使艾草的精華液發(fā)生氧化變性，因此發(fā)展一種簡(jiǎn)便，高效提取艾草精華液仍然是一項(xiàng)有待解決的技術(shù)難題.索式提取是基于溶液回流和虹吸原理，它將溶劑蒸氣源源不斷地通入提取器內(nèi)，對(duì)固體物質(zhì)進(jìn)行純?nèi)軇┑妮腿?，?dāng)溶劑的液面超過(guò)虹吸管的最高處時(shí)，溶液回流至溶劑底部，因此它可以萃取出固體物質(zhì)的有效成份，具有萃取效率高，易操作，易控制等特點(diǎn)，目前，國(guó)內(nèi)對(duì)艾草精華液的提取工藝有一定的研究，但以索式提取器提取艾草精華液的研究鮮有報(bào)道，而且目前所報(bào)道的工藝都是基于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐步探索，缺乏一種高效的統(tǒng)計(jì)理論指導(dǎo)作為優(yōu)化提取工藝參數(shù)的方法.響應(yīng)曲面法是基于隨機(jī)過(guò)程的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)方法，它能夠建立連續(xù)變量的曲面模型，優(yōu)化工藝參數(shù)，它可以通過(guò)對(duì)實(shí)際若個(gè)自變量對(duì)實(shí)際因變量的評(píng)價(jià)，從理論上給出最優(yōu)方案，此方法節(jié)省了大量的時(shí)間和人工勞動(dòng)力，達(dá)到高效地理論指導(dǎo)實(shí)踐的目的.該論文根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計(jì)原則，優(yōu)化索式提取器提取艾草精華液的工藝條件，為提取艾草精華液的工藝提供一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮艾草莖葉：購(gòu)自惠州馬莊市場(chǎng)，該批艾草種植于馬莊福長(zhǎng)嶺農(nóng)田區(qū)，收割于八月份，約60cm高，經(jīng)過(guò)60 C鼓風(fēng)干燥箱烘干后用球磨機(jī)粉碎并篩分80目以下的粉末作為抽提物；100%乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 主要儀器設(shè)備

JJ600型電子天平：美國(guó)雙杰高電子天平有限公司；752N-Plus紫外可見(jiàn)分光度計(jì)：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；101A-3ET型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；UV2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：杭州庫(kù)倫科技有限公司；高速中藥粉碎機(jī)：鄭州長(zhǎng)城科技貿(mào)工有限公司.

1.3 艾草精華液的提取

準(zhǔn)確稱取艾草粉10 g放入150 mL索式提取器的濾紙筒中，在圓底燒瓶加入90 mL一定濃度的乙醇溶液，水浴加熱回流至虹吸管的冷凝液剛剛虹吸下去時(shí)即可表示反應(yīng)完成，停止反應(yīng)，稍冷后，改成蒸餾裝置，把提取液中的乙醇蒸出，趁熱把瓶中的剩余液稀釋定容至500 mL以作進(jìn)一步的測(cè)試.

1.4 艾草精華油最大波長(zhǎng)的確定

取稀釋后精華液1 mL，掃描其紫外-可見(jiàn)光譜，結(jié)果如圖1所示，其最大吸收波長(zhǎng)為670 nm，以此波長(zhǎng)作為最大吸收波長(zhǎng)作吸光度值的測(cè)試.

圖1 艾草精華液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以10 g粉碎的艾草為提取物，在固定濃度為90%的乙醇水溶液，液料比為40∶1，提取溫度為75 C的條件下，變動(dòng)其中一個(gè)因素，按照2.3的步驟得到精華油，并測(cè)試其吸光度，以驗(yàn)證艾草精華液的相對(duì)含量高低.

乙醇水溶液的濃度：100%、90%、80%、70%、60%、50%（體積比）等6個(gè)水平濃度.

液料比分別為：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g）等6個(gè)比例加入無(wú)水乙醇.

提取溫度分別為：60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C等6個(gè)水浴溫度下提取.

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取的艾草精華液在分光光度計(jì)670nm處的吸光度為測(cè)試值，以乙醇水溶液的濃度、液料比和提取溫度為自變量，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，在Design-Expert.8.06分析軟件上采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取艾草精華油工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

2 艾草精華油提取工藝的優(yōu)化

2.1 乙醇濃度對(duì)吸光度的影響

從圖2可以看出，隨著提取工藝中乙醇濃度的升高，吸光度增加，這是由于高濃度的乙醇有利于浸出艾草中的精華油，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的提高，提取液由淡黃色變成亮綠色.因此選用濃度為100%乙醇作為最佳的提取劑.

圖2 不同的乙醇濃度對(duì)提取的艾草精華油的吸光度的影響

2.2 液料比對(duì)吸光度的影響

從圖2可以看出，液料比增大時(shí)，吸光度增加.液料比在10∶1-20∶1和50∶1-60∶1這兩個(gè)階段變化不大，這是由于液料比在這兩個(gè)階段都處于最高值和最低值，在低料液比時(shí)，溶劑萃取效率較低，因此精華油的濃度較低，吸光度較小，在50∶1-60∶1處的液料比時(shí)，由于溶劑增加，能夠促進(jìn)精油的溶出，因此吸光度最高，但較多的溶劑容易造成溶劑的浪費(fèi).綜合經(jīng)濟(jì)上的考慮，選取50∶1比較合適.

圖3 不同的液料比對(duì)提取的艾草精華油的吸光度影響

2.3 提取溫度對(duì)吸光度的影響

從圖4可以看出，隨提取溫度的增加，吸光度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)溫度在80 C時(shí)，其提取效率最高.這可能是當(dāng)溫度升高時(shí)，艾草精華油的分子運(yùn)動(dòng)變得更加劇烈，易于從艾草體相中溶出，使精華油的浸出率增加.但是過(guò)高的溫度如85 C時(shí)會(huì)使精華油分子分解從而遭到破壞，使析出精油的顏色深度降低，導(dǎo)致吸光度降低.因此，選取80 C作為提取溫度較合適.

圖4 不同的提取溫度對(duì)提取的艾草精油的吸光度影響

3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了使吸光度的值相對(duì)誤差最小，對(duì)所得到的溶液再稀釋至原來(lái)2倍體積，使吸光度的值落在0.15-0.80范圍內(nèi).以乙醇的濃度、液料比和提取溫度為自變量，以吸光度值為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的試驗(yàn)原則設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)軟件Design-Expert.8.05b分析的結(jié)果，進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到吸光度（Y）對(duì)乙醇的濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析表

圖5 A乙醇濃度和B液料比（a）、A乙醇濃度和C提取溫度（c）、B液料比和C提取溫度（c）與吸光度值組成的響應(yīng)曲面及三維立體等高線圖

由表3回歸方程各項(xiàng)方差分析表可知，模型的F值為31.37（P＜0.001），表明該模型達(dá)到極為顯著水平，當(dāng)有噪聲影響時(shí)，僅有＜0.01%的機(jī)率出現(xiàn)誤差.表中，當(dāng)P＜0.001時(shí)，表示該項(xiàng)表現(xiàn)為極顯著，當(dāng)P的值＜0.0500時(shí)，表示該項(xiàng)表現(xiàn)為顯著.從表可以看出，液料比（B）和提取溫度（C）對(duì)艾草提取精華油吸光度顯著，而乙醇濃度對(duì)艾草提取精華油的吸光度不顯著，乙醇濃度和液料比之間兩兩因素的交互作用影響顯著，而乙醇濃度和提取溫度、液料比和提取溫度的兩兩因素交互作用影響不顯著.決定系數(shù)（R2=0.9758）與調(diào)整系數(shù)（Radj=0.9447）相差不大，說(shuō)明該模型擬合度良好，適用于確定該實(shí)驗(yàn)最佳工藝.

圖5是表3結(jié)果中AB、AC和BC兩兩因素交互作用，即乙醇濃度和液料比、乙醇濃度和提取溫度、液料比和提取溫度與吸光度值組成的響應(yīng)曲面及三維立體等高線圖，它表征的是各因子之間的兩兩交互作用.

在這些圖中，選取其中兩個(gè)自變量，其它因素不變對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面分析.當(dāng)?shù)雀呔€的形狀越圓時(shí)，兩個(gè)自變量的因素作用較弱，當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)橢圓形時(shí)，這兩個(gè)自變量的因素作用就越強(qiáng).從圖5a可以看出，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著乙醇濃度和液料比的增加，吸光度呈現(xiàn)先急速增加后趨于平緩；表明乙醇濃度和液料比對(duì)吸光度影響顯著；對(duì)于5b和5c的3D圖可以看出，當(dāng)液料比（乙醇濃度）固定時(shí)，隨著兩兩交互因素的數(shù)值增加出現(xiàn)一個(gè)最高值，然后吸光度減小，但5b比5c曲線更平滑，說(shuō)明AC比BC的兩兩交互因素影響更弱，這與前面的表3的P值結(jié)果描述相一致.

由軟件得到了提取艾草精華油最佳的條件為乙醇濃度90.27%、液料比41.78、提取溫度76.32 C，在此最優(yōu)條件下軟件算得的吸光度為0.646.考慮到實(shí)際的可操作性，將條件調(diào)整為：乙醇濃度90%、液料比40、提取溫度76 C，經(jīng)過(guò)3次平行重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，得出艾草精華油的平均吸光度為0.638，與方程預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.24%.由此可知，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與所設(shè)計(jì)的模型相符，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法得到的索式提取器提取艾草精油的工藝條件是合理的.

4 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)法優(yōu)化艾草精華油的提取，結(jié)合理論的預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)的操作，得到乙醇濃度90.27%、液料比41.78、提取溫度76.32 C，在此最優(yōu)條件下軟件算得的吸光度為0.646.考慮到實(shí)際的可操作性，將條件調(diào)整為：乙醇濃度90%、液料比40、提取溫度76 C，經(jīng)過(guò)3次平行重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，得出艾草精華油的平均吸光度為0.638.其模擬的回歸方程為

通過(guò)方差與面響應(yīng)圖分析得出，各因素對(duì)艾草精華油的提取影響重要性依次為：液料比＞提取溫度＞乙醇濃度，而兩兩交互因素影響大小依次為：乙醇濃度和液料比＞液料比和提取溫度＞乙醇濃度和提取溫度.