大豆多肽-鋅螯合物的制備工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

鄭英敏,袁 楊,蘇東曉,何 山,許慶陵,曾慶祝

(廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣東廣州 510006)

大豆分離蛋白是從大豆油脂工業(yè)副產(chǎn)物——豆粕中提取出的一種蛋白質(zhì)[1]。作為富含人體所需的8種必需氨基酸,其含量滿(mǎn)足人體需求的植物蛋白[2],大豆分離蛋白因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、出色的加工性能和低成本而廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[3]。據(jù)報(bào)道,通過(guò)Alcalase酶酶解得到的大豆多肽已被證實(shí)具有抗氧化性和ACE抑制活性[4-5],而通過(guò)Flavourzyme酶酶解的大豆蛋白水解物則具有促進(jìn)脂肪代謝的生理功能[6]。

鋅是人體中僅次于鐵的第二大過(guò)渡金屬元素,以二價(jià)陽(yáng)離子形式存在,并在細(xì)胞代謝和凋亡過(guò)程包括中起著關(guān)鍵作用。鋅是銅鋅超氧化物歧化酶、碳酸酐酶、抗氧化酶和其他基質(zhì)金屬蛋白酶的酶促輔因子,參與碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)[7]。據(jù)報(bào)道,缺乏鋅會(huì)導(dǎo)致多種疾病,包括生長(zhǎng)受損、免疫系統(tǒng)缺陷、皮炎、腹瀉、性和骨骼成熟延遲,味覺(jué)受損,妊娠結(jié)局不良以及神經(jīng)行為改變等[8]。

從飲食中補(bǔ)充的鋅元素容易與植酸形成不溶性絡(luò)合物從而降低鋅的生物利用度[9]。多肽在一定配比、溫度、pH等條件下與微量金屬離子通過(guò)螯合反應(yīng)制得多肽金屬離子螯合物[10]。大量研究表明,金屬離子氨基酸螯合物比無(wú)機(jī)鹽具有更好的穩(wěn)定性,更強(qiáng)的抗干擾性和更高的生物利用度。乳清多肽-亞鐵螯合物[11]和牡蠣-鋅螯合物[12]在模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)中比相應(yīng)的無(wú)機(jī)鹽顯示更好的離子溶解度。在Caco-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中,乳清多肽的鋅及鈣螯合物的離子吸收明顯高于無(wú)機(jī)鹽[13-14]。膠原蛋白肽的鈣螯合物能顯著增加大鼠股骨礦物質(zhì)密度和股骨鈣含量[15]。Chaud等[16]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,酪蛋白肽-亞鐵螯合螯合物在大鼠血紅蛋白轉(zhuǎn)化率上與硫酸亞鐵效果一致。因此,蛋白肽的金屬離子螯合物形式被認(rèn)為是新的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。除此之外,多肽金屬離子螯合物還顯出抑菌性[17]、抗疲勞功能[18]和抗氧化性[19-20]。

已有作者如馬利華[21]和趙薇等[22]研究過(guò)豆粕多肽鋅螯合物的體外抗氧化性能和制備方法,但缺少對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究,因此本文通過(guò)酶解大豆分離蛋白制備大豆多肽,進(jìn)而制取多肽-鋅螯合物,并采用紫外光譜、傅立葉紅外光譜、熒光光譜、電子掃描顯微鏡和Zeta電位等手段方法對(duì)大豆多肽-鋅螯合物的初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,以期為多肽-鋅螯合物的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白、氯化鋅(分析純)、溴化鉀(光譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;Alcalase酶 2.4 L FG,諾維信生物技術(shù)有限公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PHS-3C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PL403電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HH4C水浴振蕩器 金壇市鴻科儀器廠(chǎng);GL-2050MS冷凍離心機(jī) 盧湘儀儀器有限公司;SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Vivaflow200超濾膜 德國(guó)賽多利斯;NexION電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;300UV-2600紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司;TENSOR II+Hyperion2000傅立葉變換紅外光譜儀 布魯克公司;F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;JSM-7001F掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;Nano-2s ZEN3600納米粒度電位儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆多肽制備 將大豆分離蛋白溶解在蒸餾水中,濃度為10%。用1 mol/L NaOH將大豆分離蛋白懸液的pH調(diào)節(jié)至8.0,并在55 ℃水浴中加熱10 min,然后加入Alcalase酶,酶與底物比例為1∶50 (W/W)。然后在55 ℃和pH8.0的條件下酶解3 h。酶解結(jié)束后,將酶解液置于沸水浴中加熱5 min滅酶。冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH至7.0隨后8000 r/min離心15 min。取上清液經(jīng)截留分子量5 kDa超濾膜分離,經(jīng)冷凍干燥后即為大豆多肽[23]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 ZnCl2濃度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱(chēng)取一定質(zhì)量的大豆多肽分別溶解于125、250、375、500和625 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,將混合液pH調(diào)節(jié)至4.0。將混合液置于60 ℃水浴中反應(yīng)3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測(cè)定其鋅螯合能力。

1.2.2.2 螯合溫度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱(chēng)取一定質(zhì)量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,調(diào)節(jié)pH至4.0。將混合液置于不同溫度(40、50、60、70、和80 ℃)中水浴反應(yīng)3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測(cè)定其鋅螯合能力。

1.2.2.3 pH對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱(chēng)取一定質(zhì)量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,用1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH(2.0、3.0、4.0、5.0和6.0)。將混合液置于60 ℃水浴中反應(yīng)3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測(cè)定其鋅螯合能力。

1.2.2.4 螯合時(shí)間對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱(chēng)取一定質(zhì)量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,調(diào)節(jié)pH至4.0。將混合液置于60 ℃水浴中分別反應(yīng)1、2、3、4和5 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測(cè)定其鋅螯合能力。

1.2.3 正交試驗(yàn) 以鋅螯合能力為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取ZnCl2濃度、溫度、pH、時(shí)間為試驗(yàn)因素,選用L9(34)正交表進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化(表1),確定大豆多肽螯合鋅的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 鋅螯合能力的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.14-2017食品中鋅的測(cè)定中的電感耦合等離子體質(zhì)譜法法,測(cè)定單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)中大豆多肽-鋅螯合物固體的鋅含量,結(jié)果用每克多肽上螯合的鋅質(zhì)量表示,即mg/g多肽。

1.2.5 大豆多肽-鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 紫外吸收光譜 取一定質(zhì)量的大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物固體溶解于去離子水中,使其濃度為1 mg/mL。在測(cè)量之前,用去離子水對(duì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行基線(xiàn)調(diào)零,測(cè)定樣品溶液190～600 nm的吸光值。

1.2.5.2 紅外光譜 分別取2 mg的大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物與200 mg光譜純KBr于瑪瑙研缽中研磨均勻。制成薄片后測(cè)定紅外吸收光譜。以4 cm-1的分辨率記錄樣品在4000～400 cm-1的光譜,平均掃描16次。

1.2.5.3 熒光光譜 取一定質(zhì)量的大豆多肽分別溶解于0、2、4、6、8和10 μmol/L ZnCl2溶液中,使其濃度為100 μg/mL,調(diào)節(jié)溶液pH至5.5,于75 ℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h。樣品在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下測(cè)定熒光光譜[24]。

1.2.5.4 掃描電子顯微鏡 取一定量大豆多肽、大豆多肽-鋅螯合物粉末于導(dǎo)電膠上,經(jīng)噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空,觀察樣品形貌。

1.2.5.5 Zeta電位 分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物溶解于去離子水中,使其濃度為1 mg/mL,用HCl或NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,測(cè)定其Zeta電位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ZnCl2濃度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 由圖1可知,ZnCl2濃度在125～375 μmol/L范圍,大豆多肽鋅螯合能力隨ZnCl2濃度的上升而增大。當(dāng)ZnCl2濃度為375 μmol/L時(shí),大豆多肽螯合能力為(16.76±0.35) mg/g。由此可知,當(dāng)ZnCl2濃度為375 μmol/L時(shí),大豆多肽中的鋅螯合位點(diǎn)已達(dá)到飽和狀態(tài)。所以在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中,選擇ZnCl2濃度為375 μmol/L。

圖1 ZnCl2濃度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.1 Effect of ZnCl2 concentration on zinc-chelating capacity of soy peptides 注:不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)；圖2～圖4同。

2.1.2 螯合溫度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 由圖2可知,溫度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響較大。隨著溫度的增加,大豆多肽的鋅螯合能力也隨之增加,在70 ℃時(shí)達(dá)到最大(24.65±0.48 mg/g),隨后下降。在40～70 ℃內(nèi),反應(yīng)溫度越高,螯合反應(yīng)的反應(yīng)速率和平衡系數(shù)越大,然而,過(guò)高溫度會(huì)導(dǎo)致多肽變性,從而導(dǎo)致大豆多肽鋅螯合能力下降[25]。因此,選擇70 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 溫度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.2 Effect of temperature on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.1.3 pH對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 圖3展現(xiàn)了不同pH下的多肽鋅螯合能力。在pH5.0時(shí)多肽的鋅螯合能力達(dá)到最大,為(18.05±0.59 mg/g)。當(dāng)pH小于5.0時(shí),多肽的鋅螯合能力隨著pH的減小而下降,這是因?yàn)镠+會(huì)與金屬離子競(jìng)爭(zhēng)給電子基團(tuán),使多肽的鋅螯合能力降低[26]。當(dāng)pH大于5.0時(shí),多肽的鋅螯合能力也減小,因?yàn)榉磻?yīng)體系中的Zn2+與OH-生成不溶性Zn(OH)2沉淀,使得體系中的Zn2+不能充分與大豆多肽進(jìn)行螯合反應(yīng)[12]。因此選擇pH5.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 pH對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.3 Effect of pH on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.1.4 螯合時(shí)間對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響 從圖4得知,大豆多肽與鋅的螯合能力隨著螯合時(shí)間的上升而上升,在反應(yīng)為3 h時(shí)達(dá)到最大值(16.04±0.63 mg/g),隨后下降。然而反應(yīng)時(shí)間的改變對(duì)大豆多肽的鋅螯合能力影響并不顯著。因此在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中將選擇1 h作為螯合時(shí)間,并不再作為后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)因素。

圖4 時(shí)間對(duì)大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.4 Effect of time on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2中R值可知,試驗(yàn)中溫度對(duì)大豆多肽鋅螯合能力影響最大,其次為pH,最后是ZnCl2濃度。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,最佳的反應(yīng)條件為第7組A3B1C3,即ZnCl2濃度450 μmol/L,溫度65 ℃,pH5.5。但通過(guò)極差分析得到的優(yōu)方案為A3B3C3,即ZnCl2濃度450 μmol/L,溫度75 ℃,pH5.5。再就這兩組方案進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),最終確定出最優(yōu)反應(yīng)條件為A3B3C3,在此條件下大豆多肽螯合能力為(26.96±1.22) mg/g。

表2 大豆多肽鋅螯合能力正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of zinc-chelating capacity of soy peptides by orthogonal optimization test

2.3 大豆多肽-鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外吸收光譜 圖5為大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物的紫外吸收光譜。大豆多肽在205 nm處出現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰,在273 nm處出現(xiàn)一個(gè)弱吸收峰。這兩個(gè)吸收峰分別是由肽鍵的發(fā)色基團(tuán)(C=O)發(fā)生π→π*躍遷和酪氨酸中的苯環(huán)引起的[27-28]。而大豆多肽-鋅螯合物的紫外吸收峰發(fā)生明顯的移動(dòng)和強(qiáng)度變化。大豆多肽-鋅螯合的最大吸收峰移動(dòng)至224 nm,吸收強(qiáng)度降低,而較弱的吸收峰發(fā)生藍(lán)移且吸收強(qiáng)度增大。結(jié)果表明,當(dāng)大豆多肽-鋅螯合物生成,發(fā)色基團(tuán)(-C=O,-COOH)和助色基團(tuán)(-OH,-NH2)發(fā)生偏振變化[29]。黃瓜種子肽-鈣螯合物[28]和豬骨膠原肽-鈣螯合物[30]也呈現(xiàn)出相似的紫外光譜。紫外光譜的變化證明大豆多肽和鋅離子之間發(fā)生了螯合反應(yīng)。

圖5 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紫外吸收光譜Fig.5 UV spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.2 傅立葉紅外光譜 圖6為大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物的紅外光譜。在大豆多肽的紅外光譜中,出現(xiàn)了由N-H鍵的拉伸振動(dòng)引起的吸收峰[12,31](3471.62 cm-1),而在大豆多肽-鋅螯合物中該吸收峰移動(dòng)至3417.27 cm-1。這表明感應(yīng)效應(yīng)或偶極場(chǎng)效應(yīng)改變了-NH2的電子云密度[27],說(shuō)明-NH參與了多肽與鋅離子的螯合反應(yīng)。在大豆多肽的紅外光譜中,波長(zhǎng)為1657.81 cm-1的吸收峰對(duì)應(yīng)-C=O[27,32]。在大豆多肽-鋅螯合物中,該吸收峰移動(dòng)至1650.65 cm-1;出現(xiàn)了一個(gè)由-COO-Zn引起的新吸收峰[33](1242.64 cm-1),以上表明多肽中的羧基為螯合位點(diǎn)之一。與鋅離子螯合后,大豆多肽中的吸收峰(864.70和529.70 cm-1)分別移動(dòng)至857.54和536.86 cm-1,這說(shuō)明多肽與鋅離子的螯合反應(yīng)使-N-H電子云密度降低[29]而-O=C-NH2電子云密度增加[33]。總結(jié)紅外光譜結(jié)果,可以推斷出大豆多肽與鋅離子的螯合位點(diǎn)為羧基、氨基以及肽鍵[14,34]。

圖6 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紅外光譜Fig.6 FTIR spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.3 熒光光譜 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可以產(chǎn)生內(nèi)源性熒光,因此可以用熒光光譜來(lái)探究蛋白質(zhì)或多肽和其他物質(zhì)間的相互作用[14]。在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下,發(fā)射峰305和348 nm分別對(duì)應(yīng)酪氨酸和色氨酸[29]。從圖7中可得知,隨著Zn2+濃度的增加,大豆多肽-鋅螯合物在305和348 nm出的熒光強(qiáng)度逐漸下降,這是由鋅離子導(dǎo)致多肽的折疊造成的[24]。根據(jù)Beyer等[35]的報(bào)道,金屬離子能促進(jìn)多肽的折疊。因此多肽和鋅離子的螯合反應(yīng)使多肽發(fā)生折疊,從而使熒光強(qiáng)度略微下降。

圖7 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紅外熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.4 掃描電子顯微鏡 圖8分別為大豆多肽粉末及大豆多肽-鋅螯合物粉末的形態(tài)圖?？梢钥闯?二者均為不規(guī)則的顆粒體,大豆多肽粉末為比較平滑的塊狀外觀,而大豆多肽-鋅螯合物粉末則呈現(xiàn)出顆粒凹凸?fàn)顟B(tài)。有文獻(xiàn)報(bào)道,金屬離子能使Aβ肽迅速聚集,形成寡聚物[36]。Dionisio等[37]指出鋅離子可能在兩個(gè)多肽的結(jié)合位點(diǎn)上充當(dāng)橋接配體。因此,可以推測(cè),大豆多肽粉末和大豆多肽-鋅螯合物粉末的形貌區(qū)別可能是由于多肽與鋅離子發(fā)生了螯合反應(yīng),形成了多肽-鋅螯合物微顆粒。

圖8 大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物掃描電子顯微鏡圖譜Fig.8 SEM of soy peptides and soy peptides-Zn chelate

2.3.5 Zeta電位 圖9為大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物在不同pH下的Zeta電位。可以看出,大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物的Zeta電位變化程度不同,當(dāng)pH超過(guò)2.7,大豆多肽-鋅螯合物的Zeta電位開(kāi)始低于大豆多肽的Zeta電位。在本實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi),隨著pH的增加,多肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性比大豆多肽差,說(shuō)明鋅離子和多肽的部分基團(tuán)結(jié)合形成螯合物以后促進(jìn)了聚集作用的發(fā)生,更加有利于形成微顆粒[38]。

圖9 大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物在不同pH下的Zeta電位曲線(xiàn)Fig.9 Zeta potential curve of soy peptides and soy peptides-Zn complex at different pH values

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定大豆多肽-鋅螯合物的制備條件為:多肽與鋅的反應(yīng)溫度75 ℃,溶液pH5.5以及氯化鋅濃度為450 μmol/L。在此條件下的鋅螯合能力為(26.96±1.22) mg/g。通過(guò)紫外吸收光譜和紅外光譜確定生成了大豆多肽-鋅螯合物,其螯合位點(diǎn)為多肽的羧基、氨基和肽鍵。熒光光譜、電子掃描顯微鏡和Zeta電位的結(jié)果表明,在Zn2+與大豆多肽的螯合過(guò)程中,受到Zn2+的影響,加強(qiáng)了多肽分子內(nèi)和分子間的相互作用,從而促進(jìn)折疊和聚集形成多肽-鋅螯合物的微顆粒?；诖蠖苟嚯牡匿\螯合物為開(kāi)發(fā)新的鋅補(bǔ)充劑提供了研究思路和理論基礎(chǔ)。