地黃飲子HPLC指紋圖譜研究

郭司群 遲曉雪

1.呼倫貝爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008；2.呼倫貝爾市草原工作站，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008

地黃飲子出自《黃帝素問宣明論方》，主治瘖痱證，癥見舌強(qiáng)不能言，足廢不能用，口干不欲飲，苔黃膩，脈沉、細(xì)弱。地黃飲子是傳統(tǒng)的經(jīng)典方劑，該方臨床應(yīng)用廣泛，多用于治療阿爾茨海默病、糖尿病、心血管疾病及中風(fēng)等一系列疾病[1]，應(yīng)用十分廣泛。地黃飲子由熟地黃、山茱萸、五味子、巴戟天、麥冬、薄荷、石菖蒲、石斛等15味藥材組成。目前地黃飲子主要集中在動(dòng)物AD(阿爾茨海默病)模型的藥效學(xué)研究[2]和血中移行成分研究的血清藥物化學(xué)方面[3]，而體外成分的質(zhì)量控制研究較少。由于復(fù)方制劑組方藥材較多成分復(fù)雜，其藥效不僅僅取決于某個(gè)成分，因此本實(shí)驗(yàn)立足于對(duì)地黃飲子的指紋圖譜進(jìn)行研究，找出共有成分，為其更加準(zhǔn)確全面的進(jìn)行質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Wasters600-996 高效液相色譜儀(二級(jí)管陣列檢測(cè)器)；TGL-16G-C高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；H66MC型超聲震蕩儀(昆山市超聲儀器有限公司)；熟地黃、山茱萸、五味子、巴戟天、麥冬、薄荷、石菖蒲、石斛、遠(yuǎn)志、附子、肉蓯蓉、茯苓、肉桂、大棗、姜(購(gòu)于哈爾濱三棵樹藥材市場(chǎng)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)謝寧教授鑒定為正品)；自制10批地黃飲子(按生產(chǎn)日期編制批次)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)迪馬公司)；甲酸胺(分析純，天津科密歐試劑有限公司)；馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)：111640-201707 ，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅡ2.0 mmid×75 mm(SHIMADZU)；流動(dòng)相：采用乙腈(A)-0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺(B)體系，梯度洗脫程序?yàn)橐译鏉舛忍荻?.0%(0 min)，5.0%～50%(0～10 min)，50%～80%(10～15 min)，80%～95%(15～17 min)。柱溫：30℃；流量：0.3 mL-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取馬錢苷對(duì)照品10 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度搖勻即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取地黃飲子組成15味藥材各15 g，混勻粉碎，粉末放于烘箱中烘至恒重，取地黃飲子粉末1 g或單味藥材粉末66 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，浸泡20 min后超聲30 min，上清液3000 r ·min-1離心15 min，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3 精密度試驗(yàn) 取同一批地黃飲子粉末，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，共有峰的保留時(shí)間RSD(%)小于1%，峰面積的RSD(%)小于1%，符合指紋圖譜要求。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取自制5批地黃飲子粉末，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品溶液，平行制備5份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果各共有峰峰面積的RSD(%)小于1%，保留時(shí)間的RSD小于1%，表明方法重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述地黃飲子粉末，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，各共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD(%)均小于1%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 地黃飲子指紋圖譜的建立

取10批自制地黃飲子粉末，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采集指紋圖譜(見圖-1)，以馬錢苷峰作為參照峰(S峰)，共選取標(biāo)定了18個(gè)共有峰(共有峰總面積占總峰面積的 70%以上)(見圖2)。計(jì)算各共有峰峰面積與參照峰峰面積的比值(相對(duì)峰面積)，并使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A 版)》，對(duì)10 批地黃飲子指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，設(shè)置樣品參照譜，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，手動(dòng)多點(diǎn)校正，不同批次的相似度在0.889～0.979之間。見表1。

圖2 地黃飲子復(fù)方樣品 HPLC-DAD指紋圖譜共有模式

圖1 十批次地黃飲子復(fù)方樣品HPLC-DAD指紋圖

表1 指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

表1 指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

4 主要色譜峰的鑒定

按與樣品相同的色譜條件分析得到馬錢苷對(duì)照品的HPLC色譜圖。采用保留時(shí)間對(duì)照法，對(duì)樣品中5號(hào)成分進(jìn)行定性分析，采用HPLC-DAD紫外檢測(cè)技術(shù)，將所得圖譜的形狀、吸收帶位置及相對(duì)強(qiáng)度與馬錢苷對(duì)照品紫外光譜圖進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)5號(hào)峰保留時(shí)間和紫外光譜圖均與馬錢苷相同(見圖3、圖4)，所以確定5號(hào)成分為馬錢苷。

A馬錢苷 B地黃飲子復(fù)方樣品圖3 地黃飲子復(fù)方樣品、馬錢苷UPLC-DAD色譜圖比較(254nm)

A馬錢苷 B地黃飲子復(fù)方樣品5號(hào)峰圖4 馬錢苷與地黃飲子復(fù)方樣品5號(hào)峰紫外吸收光譜圖比較

5 討論

本實(shí)驗(yàn)考察有機(jī)相：甲醇、乙腈和水相：水、磷酸水、0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸+10mmoL·L-1甲酸胺體系所得色譜圖中色譜峰較多且分離度較好，故選用此體系。采用二極管陣列檢測(cè)器，考察220 nm、240 nm、254 nm、280 nm、300 nm和330 nm處的圖譜特征，當(dāng)波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，成分較多且基線平滑，最終確定波長(zhǎng)為254 nm。

地黃飲子具有滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)、開竅化痰的功效，多用于腦血栓、腦血管意外、中風(fēng)、泛發(fā)性神經(jīng)皮炎、老年病等多種腦部疾病的治療。山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的功效，與地黃飲子滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)之功效相吻合。而馬錢苷屬環(huán)烯醚萜苷類，是山茱萸中的主要藥效成分之一，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用，對(duì)非特異性免疫功能也有增強(qiáng)作用，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能，延緩衰老[4]，這與地黃飲子用于腦部疾病的功用相吻合。對(duì)于其他17種共有成分同樣可依據(jù)上述的保留時(shí)間，紫外圖譜對(duì)照法，進(jìn)行進(jìn)一步的定性分析研究，從而為地黃飲子體外質(zhì)量控制研究提供更加全面的依據(jù)。