蒙藥三味阿拉坦其其格散的急性毒性試驗(yàn)

特日格樂 蘇龍嘎 齊和日瑪 興安 包納日斯 薩仁高娃

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

蒙藥經(jīng)典方劑三味阿拉坦其其格散，別名三味木鱉散、日來那木吉樂。有消除“希拉”，鎮(zhèn)“赫依”功能，主治綜合性“希拉”病，由木鱉子(炮制)、玫瑰花、金色訶子組成的傳統(tǒng)蒙藥。相關(guān)研究表明，木鱉子具有毒性，皂苷和木鱉子素為其主要毒性成分[1-4]，一般炮制后才用于臨床[5]。木鱉子有多種炮制方法，不同方法炮制的木鱉子含油量均不同，且其他有效成分的相對(duì)含量也隨之不同，因而影響其毒性和藥理作用[6-7]。傳統(tǒng)蒙藥木鱉子的炮制方法大多采取砂炒法。目前，國內(nèi)外對(duì)木鱉子的化學(xué)成分、毒性以及藥理作用均進(jìn)行了一定程度的探索研究，但尚缺乏對(duì)含木鱉子復(fù)方藥的安全性評(píng)價(jià)。

三味阿拉坦其其格散最早在蒙醫(yī)古籍《蘭塔布》[8]中記載，又相繼在《蒙醫(yī)金匱》[9]《蒙醫(yī)方劑選編》[10]等中記載，“炮制木鱉子5 g、金色訶子12.5 g、玫瑰花25 g比例制成散劑，有清希拉之效，主治有口苦、目黃、發(fā)燒、頭疼等癥狀的綜合性希拉病”。由于方劑當(dāng)中含有木鱉子，且安全性評(píng)價(jià)和藥理作用方面的研究至今空白，導(dǎo)致臨床使用率越來越低。因此，三味阿拉坦其其格散的臨床安全應(yīng)用以及新型成藥的研發(fā)都急切需要安全性評(píng)價(jià)研究。筆者通過開展三味阿拉坦其其格散急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，力求為其臨床用藥提供安全范圍。

1 材料與方法

1.1 藥材 蒙藥方劑三味阿拉坦其其格散的3種單藥：木鱉子仁(批號(hào)1510001)、訶子(批號(hào)171101313)均購自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)藥有限公司，玫瑰花(批號(hào)170201335)購自河北濟(jì)鑫堂藥業(yè)有限公司，藥材由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙藥學(xué)教研室鑒定為正品。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠140只，雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)，體重18～22 g，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0010。

1.3 試劑 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(批號(hào): 20180223)購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；水合氯醛(批號(hào)：20180110)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醛溶液(批號(hào)：20181013)、無水乙醇(批號(hào)：20190322)購自天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；伊紅染液、蘇木素染液(批號(hào)：20190105)購自南京建成科技有限公司；Leica石蠟(德國Leica公司，批號(hào)39601006)。

1.4 儀器 灌胃針、手術(shù)剪、電磁爐、炒鍋、AK-1000A型500 g搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)、RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；NIKON ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 受試藥物制備

1.5.1.1 木鱉子的炮制以及脂肪油含量測定 本研究炮制方法和脂肪油含量測定均按照《內(nèi)蒙古蒙藥炮制規(guī)范》(2015年版)[11]進(jìn)行。取凈木鱉子，照砂燙法炮制后剝?nèi)ネ鈿げ⒐蝺艟G色種皮。炮制品粗粉用乙醚回流提取脂肪油，計(jì)算得知脂肪油含量為27.35%，在木鱉子炮制品的脂肪油含量范圍內(nèi)(25%～30%)。

1.5.1.2 三味阿拉坦其其格散配制 稱取炮制木鱉子5 g,金色訶子12.5 g,玫瑰花25 g,嚴(yán)格按照《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》(2007年版)[12]散劑制作法配制，再稱取適量三味阿拉坦其其格散粉末，加入1%CMC-Na溶液制成0.43 g/mL(小鼠12號(hào)灌胃針頭剛好能過的濃度)的藥品混懸液，于 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)方法 取健康SPF小鼠60只，雌雄各半，試驗(yàn)前小鼠禁食不禁水16 h，隨機(jī)分為10組，每組6只。設(shè)能通過小鼠12號(hào)灌胃針頭的最大濃度為最大濃度，再以1：0.85的組間劑量比稀釋，得出單次給藥劑量分別為17.2 g/kg、14.62 g/kg、12.42 g/kg、10.56 g/kg、8.98 g/kg、7.63 g/kg、6.49 g/kg、5.51 g/kg、4.69 g/kg、3.98 g/kg。以0.4 mL/10g體積灌胃給藥2次/d，給藥間隔6 h，連續(xù)觀察7 d，記錄動(dòng)物死亡情況。根據(jù)小鼠死亡情況找出最大致死量Dmax和最小致死量Dmin。

1.5.3 正式試驗(yàn)方法 取健康SPF小鼠80只，雌雄各半，試驗(yàn)前小鼠禁食不禁水16 h，隨機(jī)分為7組給藥組和1組空白對(duì)照組，每組10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，單次給藥最大致死量Dmax為12.42 g/kg，最小致死量Dmin為4.69 g/kg，按K值計(jì)算出各組單次給藥劑量分別為12.42 g/kg、10.56 g/kg、8.98 g/kg、7.63 g/kg、6.49 g/kg、5.51 g/kg、4.69 g/kg，從高劑量到低劑量依次為A-G組，空白對(duì)照組為H組。給藥組(A-G組)以0.4 mL/10g體積灌胃給藥,2次/d，給藥間隔6 h，空白對(duì)照組(H組)以0.4 mL/10g體積灌胃1%CMC-Na溶液,2次/d，灌胃間隔6h。連續(xù)觀察7d，記錄動(dòng)物死亡情況，最終計(jì)算半數(shù)致死量(LD50值)。

1.5.4 觀察指標(biāo) 給藥后觀察小鼠的眼、口、鼻等有無異常分泌物，觀察小鼠的中毒表現(xiàn)及記錄死亡情況；給藥當(dāng)天4 h內(nèi)，每小時(shí)觀察臨床體征及死亡率，共4次。以后每天觀察并稱重。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行大體解剖。其他動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察重要臟器(心、肝、脾、肺、腎) 是否發(fā)生體積、顏色、質(zhì)地等改變[13]。再選取各臟器進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察病理改變。

1.5.5 計(jì)算半數(shù)致死劑量 采用改良寇氏法[13]進(jìn)行半數(shù)致死劑量計(jì)算。lgLD50=Xm-i(∑p-0.5) ，LD50的 95%置信區(qū)間計(jì)算公式為： Log-1(logLD50±1.96×Sx50)，式中Xm為最大劑量組對(duì)數(shù)值；i為相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值；∑p為各組動(dòng)物反應(yīng)率之總和；Sx50：logLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 0% 和100%估計(jì)致死劑量(Dmax 、Dmin)分別為2×12.42 g/kg和2×4.69 g/kg。見表1。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 正式試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 中毒體征觀察 給藥后4 h內(nèi)部分小鼠出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少、靜伏、卷縮、所有小鼠出現(xiàn)飲食飲水量減少等表現(xiàn)，但無小鼠死亡。第2次給藥6 h后出現(xiàn)小鼠死亡，76 h后再無小鼠死亡。觀察2 d后幸存小鼠攝食飲水基本恢復(fù)正常，狀態(tài)良好，觀察7 d無其他異?，F(xiàn)象發(fā)生。

2.2.2 體重變化 如圖表1所示，最高劑量組(A組)在第2次給藥后體重減輕，并在76 h內(nèi)全部死亡。給藥組(B-G組)小鼠跟空白組(H組)比較，在第2次給藥后3 d內(nèi)出現(xiàn)體重增加減慢、不穩(wěn)定甚至體重減輕情況，第3天后開始穩(wěn)定且正常增長。

2.2.3 組織病理學(xué)觀察 死亡小鼠即刻解剖，常規(guī)飼養(yǎng) 7d 后所有小鼠處死解剖，心、肝、脾、肺、腎形態(tài)、顏色、質(zhì)地均正常，肉眼未觀察到明顯病變。組織病理學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。

圖1 體重變化曲線

圖1 兩種劑量三味阿拉坦其其格散對(duì)小鼠不同組織病理學(xué)的影響 (HE, ×200)

給藥組：高劑量給藥組(B組)和低劑量給藥組(G組)肝臟小葉內(nèi)均可見少量炎性細(xì)胞灶性浸潤，大量肝細(xì)胞輕度空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見微小空泡。B組肝臟伴少量色素沉著，G組肝臟匯管區(qū)少量橢圓形細(xì)胞增生。脾臟均可見生發(fā)中心及少量凋亡小體，紅髓內(nèi)可見大量髓外造血細(xì)胞，且多核巨細(xì)胞增生。B組脾臟少量細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，胞核碎裂。肺臟、腎臟、心臟、未見明顯病理變化。

空白對(duì)照組：(H組)肝臟小葉內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞灶性浸潤，肝細(xì)胞輕度空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見微小空泡。脾臟：紅髓內(nèi)可見少量髓外造血細(xì)胞和多核巨細(xì)胞增生。肺臟、腎臟、心臟、未見明顯病理變化。

以上除環(huán)境等原因所致的各組肝臟少量炎性細(xì)胞浸潤和輕度空泡變性、脾臟少量髓外造血細(xì)胞和多核巨細(xì)胞少量增生病變外，兩種不同劑量給藥組(B組、G組)肝臟均發(fā)生大量空泡變性，脾臟淋巴細(xì)胞均發(fā)生凋亡病變。且兩種劑量對(duì)于肝臟和脾臟的影響在程度上有一定的不同：G組肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)少量橢圓形細(xì)胞增生，而B組肝臟出現(xiàn)少量色素沉著，脾臟出現(xiàn)少量細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，胞核碎裂等病變。所以以上肝臟和脾臟的病變可能與藥物使用有關(guān)，且隨著濃度的增加毒性作用更大。但對(duì)小鼠心、肺、腎組織無明顯影響。

2.2.4 半數(shù)致死量的測定 半數(shù)致死量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，結(jié)果按改良寇氏法公式計(jì)算得出LD50為16.03 g·kg-1，95 % CI為11.38 ～22.60 g·kg-1。

表2 半數(shù)致死量測定結(jié)果

3 討論

三味阿拉坦其其格散作為蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑，始載于17世紀(jì)的著作《蘭塔布》[8]中，相續(xù)在多個(gè)蒙醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中記載，是治療綜合性“希拉”病經(jīng)典方劑。由于臨床應(yīng)用安全性的缺乏，導(dǎo)致臨床使用率和生產(chǎn)率逐年降低。筆者通過觀察蒙藥三味阿拉坦其其格散對(duì)小鼠的急性毒性表現(xiàn)，改良寇氏法計(jì)算LD50，初步對(duì)其安全性進(jìn)行了探索與評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：三味阿拉坦其其格散第2次給藥6 h后小鼠出現(xiàn)死亡，76 h后再無小鼠死亡，觀察3 d后攝食量及體重基本恢復(fù)正常，說明三味阿拉坦其其格散具有一定毒性。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示：三味阿拉坦其其格散兩種不同劑量均對(duì)小鼠肝及脾組織產(chǎn)生一定程度的影響，如肝臟大量空泡變性、橢圓形細(xì)胞增生等病變，以及脾臟淋巴細(xì)胞凋亡、細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，胞核碎裂等病變，且毒性作用隨著給藥濃度的增加而增加。對(duì)心、肺、腎等臟器組織無明顯影響?？沙醪酵茰y三味阿拉坦其其格散毒性靶器官為肝臟和脾臟。

此外，本研究得出三味阿拉坦其其格散的LD50為16.03 g·kg-1，是木鱉子提取物口服LD50[14]的4倍。小鼠體重以 20 g 計(jì)，成人體重以70 kg 計(jì)，小鼠與人的計(jì)量折算系數(shù)為0.0026，即小鼠劑量/成人劑量 = 9.1，體重為70 kg的成人臨床用量為16.03 g·kg-1/9.1×70 kg =72.15 g 。此用量為三味阿拉坦其其格散在文獻(xiàn)上記載的[15-16]臨床最大日用量(6 g)的12倍，成人日用量達(dá)到72.15 g才會(huì)出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)?，F(xiàn)實(shí)中單次用藥量基本達(dá)不到如此大的劑量，因此，臨床使用中通常不會(huì)出現(xiàn)急性中毒情況。但三味阿拉坦其其格散的慢性毒性方面至今無實(shí)驗(yàn)研究，無法確定是否存在慢性毒性，所以長期使用需注意對(duì)肝、脾功能的影響。

目前蒙醫(yī)多種方劑中經(jīng)常用其他藥效相似的藥材代替木鱉子入藥，比如與三味阿拉坦其其格散藥效相似的藏藥三味薔薇散中用波棱瓜子代替木鱉子入藥[17]。為了保證臨床藥效及安全性，對(duì)三味阿拉坦其其格散進(jìn)行進(jìn)一步的慢性毒性研究或毒性成分的探討，以及篩選出與君藥木鱉子藥效相似并且毒性更低的藥材代替入藥是值得進(jìn)一步深入研究的。