蒙醫(yī)五味甘露浴對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠肝GSH、GSH-Px、SOD活性及MDA含量的影響

昂格力瑪 水 玲 伊茹娜 斯 琴 陳英松

內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市土默特左旗內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)金山校區(qū)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種慢性自身免疫性疾病,伴隨著復(fù)雜的炎癥介質(zhì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)的損害、滑膜炎癥、軟骨和骨的損壞,導(dǎo)致人類和動(dòng)物嚴(yán)重的機(jī)體功能障礙[1]。目前研究表明免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的價(jià)值較高，能夠較好地輔助已有的實(shí)驗(yàn)室診斷[2]。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬蒙醫(yī)“協(xié)日烏素病”范疇，蒙醫(yī)稱關(guān)節(jié)“協(xié)日烏素病”。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為飲食起居不當(dāng)、長時(shí)間在寒濕環(huán)境中生活、氣候過于寒涼、陰雨連綿、感染引起的一種罕見病，起病緩慢，病程較長，易于復(fù)發(fā)，難于控制的一種慢性關(guān)節(jié)疾病[3]。臨床實(shí)驗(yàn)顯示，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，蒙醫(yī)五味甘露對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療有一定的療效。蒙醫(yī)五味甘露浴具有較好地免疫調(diào)節(jié)作用[4],具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[5]。蒙醫(yī)五味甘露浴是蒙古族特色療法之一，由小白蒿、水柏枝、麻黃、杜鵑葉、刺柏等5種藥物組成。直接從體外給溫?zé)岽碳?，以達(dá)到治療疾病的目的。浴具有悠久的歷史，資源豐富，療效明顯，副作用小等特點(diǎn)[6]。佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的研究日漸增多，其抗氧化和抗炎作用受到廣泛關(guān)注。蒙醫(yī)五味甘露浴劑，具有舒筋散結(jié)、通絡(luò)止痛、益氣補(bǔ)腎、祛燥黃水等功效。臨床上主要治療四肢僵直或拘攣，關(guān)節(jié)腫痛、肌肉萎縮等“黃水”疾病。方中刺柏葉味甘、澀、性涼、輕、鈍，用以清腎熱，燥黃水；水柏芝味甘，性涼、鈍、重、固，以清熱，斂毒、祛黃水、清肉毒；小白蒿味苦，性涼、鈍、澀、燥，有通活血脈、祛燥黃水、活血化瘀、益腎壯腰等功效。麻黃味苦、澀，性涼、鈍、輕、澀、燥，有清熱，除血蟲，破痞消腫，發(fā)汗止痛[7]之效；照白山味甘、苦、澀，性溫、輕、大毒，有祛巴達(dá)干，祛痰等功效。

本實(shí)驗(yàn)采用CFA (完全弗氏佐劑)誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)模型大鼠。觀察治療前后大鼠肝臟GSH、GSH-Px、SOD活性及MDA含量的變化，探討蒙醫(yī)五味甘露浴的抗氧化，疏通氣血作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 蒙醫(yī)五味甘露浴劑(批號(hào):720121110，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙中醫(yī)醫(yī)院中心制劑室提供)；完全弗氏佐劑(CFA，Sigma公司提供)；GSH(谷胱甘肽)，GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)，SOD(超氧化物歧化酶)，MDA(丙二醛),ELISA檢測(cè)試劑盒，北京新亞太生物科技有限公司提供，批號(hào)分別為DZE30786，DZE30787，DZE30267，DZE30266；

80-2式離心機(jī)：金壇市化城敏科實(shí)驗(yàn)儀器廠；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀： MULTISKAN MK3，Thermo，USA；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH4000A，天津泰斯特；MINI shaker：MH-1， kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取7周齡，清潔級(jí)雄性SD大鼠[SCxK(軍)2012-0004]30只，體重180～200 g，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，在黑暗與光明周期為12 h，溫度為(24±2)℃的環(huán)境，自由飲食水進(jìn)行3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 分組與造模 將30只SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、蒙醫(yī)五味甘露浴組，每組10只。對(duì)模型組，蒙醫(yī)五味甘露浴組大鼠進(jìn)行造模。無菌條件下在大鼠右后足趾注射0.1 mL的CFA (內(nèi)含0.1℅滅活結(jié)核桿菌) 致炎，空白組注射同劑量的0.9%的生理鹽水，之后針眼處涂抹紫藥水[6]。

1.4 治療方案 空白組在第3天開始進(jìn)行溫水浴對(duì)照，1次/d，30 min/次，連續(xù)治療15 d，藥浴方法為在50 cm×30 cm×20 cm的半透明塑料容器中加入溫度為(25±2)℃的清潔飲用水1000 mL，將大鼠的四肢和尾部浸泡在溫水中，治療結(jié)束后用清潔毛巾擦拭干凈后放入鼠籠中。

模型組在造模之后的浴療方法同空白組。

蒙醫(yī)五味甘露浴組在造模后第3天開始進(jìn)行五味甘露浴治療，藥浴濃度為33.4%，1次/d，30 min/次，連續(xù)治療15 d，藥浴方法同空白組，藥浴溫度為(40±2) ℃。

1.5 取材 末次治療后24 h，用戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，切開腹腔取下完整肝臟并稱重后置于凍存管，用液氮快速冷凍，放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)大鼠肝臟GSH，GSH-Px，SOD活性及MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝勻漿MDA含量和SOD、OGSH-Px、GSH活性的影響。

與正常組相比，模型組SOD、GSH、GSH-Px的活性明顯下降(P<0.05)，MDA的含量明顯增加(P<0.05)。五味組與模型組相比蒙醫(yī)五味甘露浴組SOD、GSH、GSH-Px的活性明顯升高(P<0.05)，MDA的含量明顯減少(P<0.05)。見表1，如圖1所示。

圖1 A表示各組SOD活性的比較；B表示各組MDA含量的比較； C表示各組GSH活性的比較；D表示GSH-Px活性的比較

表1 各組大鼠肝臟SOD、GSH、GSH-Px活性，MDA含量的比較

2.2 各組大鼠肝指數(shù)變化 與空白組比較，模型組大鼠活動(dòng)減少、體重減輕，肝臟指數(shù)明顯增加(P<0.05)，且隨著造模時(shí)間的延長，模型組大鼠炎癥的加重，表現(xiàn)為原發(fā)側(cè)足趾腫脹進(jìn)行性加重，且出現(xiàn)漸進(jìn)性的繼發(fā)性足腫脹和前足腫脹，逐漸行動(dòng)不便、站立不穩(wěn)，肝臟指數(shù)逐漸增加。與模型組比較，五位組大鼠肝臟指數(shù)明顯降低(P<0．05)。如圖2所示。

圖2 各組肝臟指數(shù)的比較

3 討論

蒙醫(yī)五味甘露浴是蒙古族特色療法之一，由小白蒿、水柏枝、麻黃、杜鵑葉、刺柏等5種藥物組成。直接從體外給溫?zé)岽碳?，以達(dá)到治療疾病的目的。浴具有悠久的歷史，資源豐富，療效明顯，副作用小等特點(diǎn)[7]。佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的研究日漸增多，其抗氧化和抗炎作用受到廣泛關(guān)注。蒙醫(yī)五味甘露浴劑，具有舒筋散結(jié)、通絡(luò)止痛、益氣補(bǔ)腎、祛燥黃水等功效。臨床上主要治療四肢僵直或拘攣，關(guān)節(jié)腫痛、肌肉萎縮等“黃水”疾病。方中刺柏葉味甘、澀、性涼、輕、鈍，用以清腎熱，燥黃水；水柏芝味甘，性涼、鈍、重、固，以清熱，斂毒、祛黃水、清肉毒；小白蒿味苦，性涼、鈍、澀、燥，以通活血脈、祛燥黃水、活血化瘀、益腎壯腰等功效。麻黃味苦、澀，性涼、鈍、輕、澀、燥，以清熱，除血蟲，破痞消腫，發(fā)汗止痛[8]；照白山味甘、苦、澀，性溫、輕、大毒。以祛巴達(dá)干，祛痰等功效。

肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的重要器官，其中的自由基代謝及抗氧化酶變化較為明顯。SOD是保護(hù)肝臟所必需的蛋白質(zhì)，對(duì)預(yù)防、修復(fù)氧化應(yīng)激引起肝損傷中具有重要的作用，也是體內(nèi)重要的防御自由基毒害的抗氧化酶，分解過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受傷。有文獻(xiàn)顯示RA患者體內(nèi)SOD含量低于正常人，SOD和MDA是相互對(duì)立的氧自由基相關(guān)因子，當(dāng)體內(nèi)SOD含量偏低時(shí)，不能防御自由基，分解不了過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，不能阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，因此MDA會(huì)增加。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，是造成細(xì)胞膜損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度。MDA增多會(huì)引起生命大分子蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生交聯(lián)聚合，故有細(xì)胞毒性。GSH是一種低分子清除劑，其量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。GSH含量增多會(huì)引起體內(nèi)過量的氧自由基造成肝細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，損傷抗氧化酶。GSH-Px是體內(nèi)催化過氧化氫分解的重要的酶，它特意催化GSH對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[9]，GSH-Px水平的高低反映著機(jī)體抗氧化能力，GSH-Px水平下降表明機(jī)體抗氧化能力的下降，導(dǎo)致機(jī)體自由基生成大量增加。

本實(shí)驗(yàn)中，AA模型組大鼠肝臟GSH、GSH-Px和SOD活性顯著降低，而MDA的濃度增加，說明AA模型組大鼠肝臟組織中存在氧化應(yīng)激作用。過量的氧自由基造成肝細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，損傷抗氧化酶，引起GSH、GSH-Px和SOD的催化作用降低甚至失活。還有研究發(fā)現(xiàn)RA患者抗氧化能力下降，在急性和慢性炎癥RA患者滑膜液內(nèi)O2的增長超過了SOD的清除能力，且SOD水平低于正常人，同時(shí)脂質(zhì)過氧化損傷增加。大量產(chǎn)生的自由基促進(jìn)軟骨的破壞，加重RA關(guān)節(jié)損傷。

與空白組比，模型組肝臟指數(shù)明顯增長，與模型組比，五味組肝臟指數(shù)明顯下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體原因還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蒙醫(yī)五味甘露浴具有抗氧化作用，能提高AA體內(nèi)降低的抗氧化能力，減輕細(xì)胞的過氧化損傷，同時(shí)能保護(hù)好AA大鼠軟骨。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蒙醫(yī)五味甘露浴對(duì)AA大鼠有抗氧化作用和對(duì)其關(guān)節(jié)有保護(hù)作用。