印度尼西亞峇淡島海域鱾新本尼登蟲（Neobenedenia girellae）形態(tài)學及28S rRNA分子鑒定

喬瑩，馬笑晚，邵彥翔，陳超

( 1. 自然資源部第四海洋研究所，廣西 北海 536000；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

1 引言

本尼登蟲作為世界海水養(yǎng)殖魚類的一種主要的寄生性單殖吸蟲，隸屬于吸蟲綱（Trematoda）單殖吸蟲目（Monogenea）分室科（Capsalidae Bard, 1853）本尼登亞科（Benedeniinae Johnston, 1931），多分布于熱帶和亞熱帶海區(qū)。本尼登蟲的宿主特異性較低，寄生宿主種類廣泛，包括各類石斑魚（Epinephelinae）、大黃魚（Larimichthys crocea）、金目鱸（Lates calcarifer）、真鯛（Pagrus major）等多種野生及養(yǎng)殖品種。本尼登蟲主要以蟲體前后吸器及鉤狀結(jié)構(gòu)吸附寄生于各類海洋魚類的體表、鰭條、鰓絲等部位，破壞魚類黏液組織，吸食宿主的表皮細胞及血液，營寄生生活。由于其寄生還可造成魚體表面創(chuàng)傷，引發(fā)繼發(fā)性的細菌感染，造成宿主死亡。至今關于本尼登蟲病感染的報道屢見不鮮[1-4]，有研究表明新本尼登蟲已成為世界漁業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中最主要的單殖類寄生蟲[5-6]，其宿主自然感染率高達70%，發(fā)病魚死亡率平均在30%～40%，最高甚至可達90%以上，給養(yǎng)殖業(yè)者帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

以往寄生蟲分類方法是以傳統(tǒng)的光學顯微鏡觀察為主，依靠觀察描述蟲體及其器官的形態(tài)、大小及位置，并記錄測量相關數(shù)據(jù)來進行形態(tài)鑒定。但傳統(tǒng)分類學方法對鑒定者經(jīng)驗要求較高，且壓片制片過程對于蟲體及器官的位置和大小影響較大，故常存在同種異名的情況，引起分類歸屬的爭議。新本尼登蟲的分類爭議同樣存在，其爭議點主要存在于新本尼登屬的10個種是否存在同種異名的情況。Whttington和Horton[7]于1996年將已有報道的10種新本尼登蟲重新進行分類，僅保留了 Neobenedenia melleni、N. adenea、N.isabellae、 N. longiprostata、 N. muelleri和 N. pacifica 6個種，N. girellae和N. pargueraensis被分為N. melleni的同種異名，但仍有學者對此分類持不同意見[8]。以核糖體基因（rRNA）和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（First Internal Transcribed Spacer，ITS）等為分子標記[9-13]在分子分類學研究的應用，很好地解決了傳統(tǒng)分類學方法的局限性，同時，鑒于該方法避免了樣品處理對蟲體形態(tài)的影響與人為形態(tài)觀察的主觀性，其已成為寄生蟲分類的一種重要方法。

本研究針對印度尼西亞峇淡島海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖的卵形鯧鲹 Trachinotus ovatus （Linnaeus，1758）體表寄生的本尼登類單殖吸蟲的形態(tài)學特征進行觀察和測量，并結(jié)合其28S rRNA基因序列的擴增結(jié)果，對其進行分類鑒定，以確定危害印度尼西亞峇淡島海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類的本尼登類單殖吸蟲種類，從而為該地區(qū)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類本尼登蟲病的防治提供依據(jù)，為國家一帶一路海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 標本采集

2017 年12 月于印度尼西亞峇淡島海域（0°38′19″N，104°15′23″E）海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱采集感染本尼登蟲的卵形鯧鲹，寄生部位：體表、鰭條、鰓絲。經(jīng)淡水浸泡后，收集脫落的寄生本尼登蟲蟲株（Isolate Batam, IB）。蟲株分別使用10%中性甲醛和90%無水乙醇固定待用。

2.2 形態(tài)學測量

采集蟲體使用蓋玻片和載玻片輕輕壓片后，使用10%中性甲醛進行固定。使用OLYMPUS光學顯微鏡對固定蟲體形態(tài)學特征進行觀察和測量。測量的形態(tài)學數(shù)據(jù)包括體長，體寬，前吸器長、寬，后吸器長、寬，咽長、寬，邊緣膜，附甲片，前鉤長，后鉤長，卵巢長、寬，睪丸長、寬，共16組數(shù)據(jù)，測量單位均以μm計, 測量蟲體數(shù)目為15～30 個, 并計算算術(shù)平均值和標準差。

2.3 28S rRNA擴增及測序

將使用適量90%無水乙醇固定的蟲株樣品，充分研磨后，12 000 r/min離心5 min，去除上清，使用無菌水重懸，充分洗滌樣品，去除無水乙醇。蟲體基因組DNA提取采用EasyPure?海洋動物基因組DNA試劑盒（Transgen Biotech，EE151-01），DNA 抽提與純化步驟參照說明書進行。

28S rRNA擴增引物選用C1: 5′-ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3′和 C3: 5′-CTCTTCAGAGTAC TTTTCAAC-3′[14]。擴增體系為：DNA模板 0.5 ng，PCR 預混體系 10 μL、Taq DNA 聚合酶 0.6 μL、上游引物C11μL、下游引物C31μL、加入無菌水至總體積50 μL。反應條件如下：95℃預變性5 min、95℃變性 30 s、55℃ 退火 45 s、72℃ 延伸2min、40個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用EasyPure?凝膠回收試劑盒（Transgen Biotech, EG101-01）純化。純化產(chǎn)物由上海生工生物工程服務有限公司進行測序。

2.4 進化樹構(gòu)建

測序序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，選取同源序列，使用MEGA X[15]軟件進行多重序列比對，結(jié)果使用 ESPript軟件（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）進行可視化展示。使用PhyML 3.0軟件[16]進行進化樹構(gòu)建，自動模型選擇使用赤池信息量準則（Akaike Information Criterion）模型，進化樹改良類型選擇SPR（Subtree Prune Regraft）。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學描述

圖1 鱾新本尼登蟲峇淡島蟲株形態(tài)圖Fig.1 Morphological structure of Neobenedenia girellae isolate Batam

形態(tài)描述：如圖1所示，蟲體呈現(xiàn)長橢圓形，體前部具有兩個前吸器，體后部具有1個后吸器；體長（包括 后 吸 器 ） 為2976.54～4186.16 μm（（3 275.33 ±516.12） μm），體寬1739.49～2 189.76 μm（（1 922.41 ±189.27） μm）；前吸器呈并列的吸盤狀，大小為 [ 279.95～472.47 μm（（364.37 ± 70.75） μm）]×[ 242.53～382.82 μm（（323.61 ± 51.62） μm）]；前吸器后具有兩對眼點，前小后大，呈八字形排列，位于咽之前。咽呈圓形，邊緣具有缺刻，大小為[ 274.80～553.95 μm（（390.37 ± 109.24） μm）]×[ 426.57～685.19 μm（（520.94±101.41） μm）]；腸管于咽之后分叉，向后延伸至蟲體末端形成盲端，并向蟲體中央及邊緣發(fā)出眾多外側(cè)分支。卵球形睪丸1對，并列排列于蟲體中部，邊緣具缺刻，大小為[ 330.57～440.95 μm（（398.31 ± 45.77） μm）]×[ 280.06～392.71 μm（（308.23 ± 47.57） μm）]；卵巢位于蟲體中部睪丸之前，無陰道結(jié)構(gòu)，大小為 [ 235.43～292.62 μm（（262.47 ±21.83） μm）]×[ 235.99～394.73 μm（（296.28 ± 67.38） μm）]；后吸器呈盤狀，無隔膜結(jié)構(gòu)，大小為[ 873.19～1 246.64 μm（（1 049.25 ± 144.62） μm） ]×[ 818.44～1 237.99 μm（（1 014.10 ± 164.83） μm）]；后吸器上具邊緣膜、附甲片、前鉤1對、后鉤1對以及邊緣小鉤數(shù)個。邊緣膜大小為 35～54.74 μm（（44.82 ± 7.28） μm）；附甲片大小為 168.58～227.91 μm（（201.12 ± 21.98） μm）；前鉤末端堅硬鋒利，長 244.09～347.4 μm（（301.05 ±46.78） μm）； 后 鉤 長 53.78～ 116.56 μm（（90.49 ±30.53） μm）（表 1，圖 2）。

3.2 28S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序獲得IB蟲株28S rRNA序列長度為394 bp（GenBank No. MN209942）。與 GenBank中同源序列的比對結(jié)果顯示，IB蟲株與其他本尼登蟲屬比對相似性在85.86%～99.47%之間。其中與鱾新本尼登蟲N. girellae isolate N1： MH843708.1，isolate IDW109-08：MH843694.1，isolate IDW04-12：MH843693.1 等相似性最高，達99.47%；與珻氏新本尼登蟲N. melleni：EU707805.1相似性為99.21%；與N. melleni isolate Zh-HGS20020517 相似性為98.91%；與Benedenia cf. seriolae FAS-2013 isolate SL93B5的相似性僅為85.86%。IB蟲株28S rRNA序列與其他同源序列比對結(jié)果如圖3所示。

基于28S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，IB蟲株與其他鱾新本尼登蟲和珻氏新本尼登蟲聚為一簇，屬于新本尼登蟲屬?？ㄊ鲜缺窍x（Nasicola klawei，HQ721184.1/ HQ721185.1/ HQ721186.1） 與 Capsala pricei（FJ971982.1）、Capsala laevis（FJ971979.1）聚為一簇，又與本尼登蟲屬種類聚類為一簇（圖4）。

表1 N. girellae isolate Batam與其他新本尼登蟲形態(tài)比較Table1 Comparison of morphological characters of N. girellae isolate Batam with other similar species

圖2 鱾新本尼登蟲光鏡觀察Fig.2 Morphology of Neobenedenia girellae isolate Batam

4 討論

長期以來，形態(tài)學特征一直是系統(tǒng)發(fā)育及分類學研究的主要依據(jù)，而單殖吸蟲類的分類多采用傳統(tǒng)分類學方法，依賴肉眼和光學顯微鏡，通過對寄生蟲外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、寄生部位、流行性規(guī)律進行觀察，從而進行分類鑒定。1963年Yamaguti[17]將單殖吸蟲分室科分為5個亞科，其中本尼登亞科至今已通過研究鑒定到包括Allobenedenia、Neobenedenia、Pseudoentobdella等16屬共50余種。本研究中，對印度尼西亞峇淡海域養(yǎng)殖卵形鯧鲹體表分離得到的IB蟲株進行觀察，結(jié)果顯示其蟲體后吸盤不具分隔，具窄邊緣膜和3對形狀不一的中央大鉤。前列腺囊包裹于陰精囊內(nèi)，無陰道結(jié)構(gòu)，根據(jù)Yamaguti[17]及Whittington和Horton[7]的分類學標準，IB蟲株具有新本尼登蟲屬的特征。

圖3 鱾新本尼登蟲28S rRNA序列同源比對Fig.3 Homology comparison of 28S rRNA of Neobenedenia girellae isolate Batam

圖4 鱾新本尼登蟲系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of Neobenedenia girellae isolate Batam

本研究中IB蟲株的各項形態(tài)特性與楊文川記錄的珻氏新本尼登蟲形態(tài)較為相似，但形態(tài)學測量數(shù)據(jù)卻存在一定的差異。已有研究表明寄生蟲的宿主種類、寄生蟲的年齡、寄生蟲樣本的處理方法均會對其蟲體大小、形態(tài)學特征有一定的影響。此外Whittington和Horton[7]的研究同樣證實了宿主的不同會導致相同種類蟲體外部形態(tài)存在一定的差異這一觀點。本研究在樣品保存及處理過程中發(fā)現(xiàn)，使用酒精及福爾馬林溶液固定的新本尼登蟲，會出現(xiàn)萎縮、褶皺等不同程度的變形。以上通過形態(tài)學方法進行分類鑒定所暴露出的問題顯示，僅僅依靠形態(tài)學的數(shù)據(jù)對新本尼登蟲進行分類的結(jié)果將會存在諸多爭議。

事實上自1963年Yamaguti[17]建立新本尼登屬Neobenedenia開始，世界各地的新本尼登蟲報道繁多，但由于該屬的分類問題一直存在較大爭議，故存在大量同種異名的情況。其中最為典型的爭議就是N. girellae與N. melleni是否為同種異名品種。N. mel-leni最早在1927年由MacCallum首次發(fā)現(xiàn)并定名為Benedenia melleni。1963年Yamaguti建立新本尼登屬后，將B. melleni更名為N. melleni，并作為該屬的模式種。N. girellae由Hargis 1955年首次發(fā)現(xiàn)并定名為B.girellae，后由Yamaguti更名并移入新本尼登屬。Hargis[18]，Yamaguti[17]，Bondad-Reantaso 等[19]，Yoshinaga 等[8]研究觀察到 N. melleni相較于N. girellae蟲體更為寬短，N. girellae具有明顯的滕腺，且兩者后吸器鉤大小及形狀不同，認為珻氏新本尼登蟲（N. melleni）和鱾新本尼登蟲（N. girellae）分別為兩個獨立的種。而Whittington等[10]則認為兩者仍存在如睪丸邊緣缺刻，無陰道等共同的內(nèi)部形態(tài)特征，故認為兩者為同種異名的品種。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，采用分子生物學技術(shù)進行物種鑒定，遺傳演化及物種親緣關系的研究逐步增多。分子生物學技術(shù)與形態(tài)學相結(jié)合，在解決寄生蟲系統(tǒng)分類以及某些疑難、易混淆種類的分類鑒定方面獲得了很大成功[9,20-21]。Gunningham等最早采用分子生物學技術(shù)對鮭魚3種三代蟲的18s rRNA進行分析研究，顯示不同蟲種18S rRNA基因的V4區(qū)域存在明顯差異，并以此設計出特異性探針來進行不同蟲種的識別[22]。楊文川等[23]對鱾新本尼登蟲生活史中發(fā)育各期幼蟲的形態(tài)進行了詳細的觀察，描述和測量，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與Theo等描述的珻氏新本尼登蟲各期幼蟲特征非常相似，認為其屬于同種異名。而張紋等[20]對于福建海區(qū)的鱾新本尼登蟲與珻氏新本尼登蟲28S rRNA序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性高達99.7%，甚至遠遠高于測定的珻氏新本尼登蟲種間相似度（99.41%），支持了兩者為同種異名品種的論點。

本研究針對印度尼西亞峇淡島海域分離得到的本尼登類寄生蟲28S rRNA進行研究，并與GenBank中本尼登蟲及新本尼登蟲等親緣物種的同源基因進行序列比對和系統(tǒng)進化研究。序列比對的結(jié)果顯示本研究中的IB蟲株與其他本尼登蟲屬的種類相似性在85.86%～99.47%之間，其中與鱾新本尼登蟲類相似性最高，達99.47%；與珻氏新本尼登蟲類相似性次之，為99.21%。而系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，IB蟲株與其他鱾新本尼登蟲和珻新本尼登蟲聚為一簇，屬于新本尼登蟲屬?？ㄊ鲜缺窍x與Capsala pricei、C. laevis單為一簇，后又與本尼登蟲屬合為一簇，顯示IB蟲株與鱾新本尼登蟲和珻氏新本尼登蟲具有非常近的親緣關系，該結(jié)果同樣從分子生物學角度支持了Whittington等[10]的研究結(jié)果，即鱾新本尼登蟲（N. girellae）和珻新本尼登蟲（N. melleni）為同一種類的同種異名。