巴戟天醇提物的提取優(yōu)化及其抗氧化活性研究

林 立 王建榮 鄭燕梅

廈門大學附屬福州第二醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350007

巴戟天(MorindaofficinalisHow)是茜草科巴戟天屬多年生攀援性木質藤本植物，別名巴戟、巴吉、雞腸風，產福建、廣東、海南、廣西等省區(qū)的熱帶和亞熱帶地區(qū)，中南半島也有分布[1]。全年均可采挖，洗凈，除去須根，其肉質根的根肉曬干即成藥材“巴戟天”，和檳榔、益智、砂仁并稱為我國四大南藥，為福建省大宗道地藥材。中醫(yī)認為其性甘、辛、微溫，歸腎、肝經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功能，可用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經不調、少腹冷痛、風濕痹痛，筋骨痿軟等病癥[2]。近年來，國內外對巴戟天屬植物的化學成分及藥理活性研究較多，其化學成分主要有蒽醌類、萘醌和萘氫醌類、環(huán)烯醚萜類、糖類、木脂素類、脂肪苷類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類等，并不斷有新的化學成分被發(fā)現(xiàn)；現(xiàn)代藥理學研究表明巴戟天能夠抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗丙型肝炎病毒作用、抗疲勞、保肝、調節(jié)免疫、調控生精功能、抗腫瘤及細胞毒作用、抗骨質疏松、抗氧化等生物活性[3-9]。對于巴戟天的提取有多種方式，一般有水提取法、酸堿提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、酶解法、微波提取法等，這些方法雖然提取率較高，但存在條件要求嚴格，操作復雜，成本較高等問題，個別方法又會破壞巴戟天的活性[10]。而對于單純乙醇提取的方法還少有提及，而且其實驗成本較低，操作簡單，提取物易于保存，因而選用乙醇為溶劑對巴戟天進行提取，研究巴戟天醇提物的生物活性。

現(xiàn)代醫(yī)學表明，人體內多余的自由基，會破壞人體細胞結構，引起脂質的過氧化，進而干擾人體正常的代謝活動，引發(fā)疾病、加速人體衰老[11]。開發(fā)和利用高效無毒的天然抗氧化劑是一直是醫(yī)學研究的重點，目前對巴戟天的體外抗氧化研究相對較少，特別是醇提取物的抗氧化活性研究比較缺乏，為了進一步發(fā)掘巴戟天的用藥潛能，探究其抗氧化能力，本實驗通過進行總抗氧化能力、DPPH自由基清除活性、還原力、ABTS自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性五種方法對巴戟天的體外抗氧化活性進行研究，為巴戟天的進一步開發(fā)利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材 巴戟天藥材為野外人工采集，采集點位于福建省南靖縣，采集植物經福建中醫(yī)藥大學楊成梓教授鑒定，認定為茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow的根。

1.2 試劑 ABTS、DPPH、NADH、NBT、PMS(美國Sigma公司)；磷酸鈉(聯(lián)試化工試劑有限公司)；硫酸(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀(國藥集團化學試劑有限公司)；三氯乙酸(天津市福晨化學試劑廠)；鉬酸銨、乙醇為國產分析純試劑。

1.3 儀器 DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱(中新醫(yī)療儀器有限公司)；RE-52旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮公司)；HH80數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州億能實驗儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵、低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科技工貿有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；多功能食品加工粉碎機(上海帥佳電子科學儀器廠)；千分之一天平(上海舜宇恒豐科學儀器有限公司)；萬分之一天平(福建省計量科技研究所)；十萬分之一天平(德國賽多利斯)；紫外-可見分光光度計(日本島津制作所)。

2 實驗方法

2.1 提取與分離 將巴戟天洗凈，置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h，粉碎，過篩。采用熱溶劑提取法提取巴戟天醇提物，將藥液靜置一段時間后真空抽濾，合并兩次濾液，置于旋轉蒸發(fā)器中減壓濃縮，溫度保持30 ℃，回收乙醇至無醇味。取一定量巴戟天醇提物于真空干燥箱中烘干，備用。在巴戟天提取物的提取過程中主要涉及的因素是提取時的溶劑濃度、提取溫度、提取時間等。實驗分別探索它們對提取過程的影響，優(yōu)化巴戟天的提取過程。

2.1.1 乙醇濃度對巴戟天醇提物得率的影響 稱取巴戟天干燥物各等分，在溫度100 ℃條件下，提取2 h，分別使用55、65、75、85、95 %的乙醇溶劑進行提取，計算乙醇濃度對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.1.2 提取溫度對巴戟天醇提物得率的影響 用75 %乙醇回流提取，每次2 h，分別在70、80、90、100、110 ℃進行提取，計算提取溫度對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.1.3 提取時間對巴戟天醇提物得率的影響 在溫度100 ℃條件下，用75 %乙醇回流提取，分別提取1、1.5、2、2.5、3 h，計算時間對巴戟天醇提物得率，三次重復試驗。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 總抗氧化能力測定[12]取0.25、0.5、1 mg/mL濃度的樣品溶液各0.3 mL(31.25～500 μg/mL)；加入3 mL的反應液(含0.6 M的硫酸，28 mM的磷酸鈉和4 mM的鉬酸銨)，置于95 ℃的水浴中反應90 min，冷卻至室溫后，在紫外695 nm波長處測定吸光值(Ai)，以BHT為陽性對照。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。80 %乙醇替代樣品溶液作空白調零。

2.2.2 DPPH清除活性[13]取5、10、20 mg/mL濃度的樣品溶液各2 mL，加入0.2 mol/L DPPH溶液2 mL，混勻后，置暗處30 min，使其充分反應，在紫外波長517 nm下分別測取各濃度吸光度(Ai)，以Vc為陽性對照。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度(A0)。

公式：DPPH自由基清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

式中：A0為空白對照吸光值；Ai為樣品吸光值。

2.2.3 還原力測定[13]取2.5、5、10 mg/mL濃度的樣品溶液各2.5 mL，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL的1 %鐵氰化鉀溶液，充分混勻，置于50 ℃條件下水浴保溫20 min；加入2.5 mL的10 %三氯乙酸，搖勻并靜置10 min；取5 mL混合溶液，加入5 mL蒸餾水與1 mL的0.1 %氯化鐵，搖勻并靜置10 min，在紫外700 nm波長處測取各濃度吸光度(Ai)。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以2.5 mL的80 %乙醇替代樣品溶液作空白調零。

2.2.4 ABTS清除活性[14]實驗用ABTS+溶液的制備：取等體積7 mM的ABTS與2.45 mM過硫酸鉀充分混勻，置23 ℃暗處反應12～16 h，得到ABTS+。加入80 %乙醇稀釋，使ABTS+溶液在紫外波長734 nm下的吸光值在(0.7±0.02)之間。

取10、20、40 mg/mL樣品溶液各0.1 mL，分別加入ABTS+(吸光度在0.7±0.02內)溶液3.9 mL，充分混勻，置23 ℃反應6 min，在紫外734 nm波長處分別測取各濃度吸光度(Ai)。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。用80 %乙醇溶液替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度(A0)。

公式：ABTS自由基清除率(%)=(A0-Ai)×100/A0

式中：A0為空白吸光值；Ai為樣品吸光值。

2.2.5 超氧陰離子清除活性[15]取0.25、0.5、1 mg/mL不同濃度的樣品溶液各1 mL，于體系中加入1 mL NBT溶液[156 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制]，1 mL NADH溶液[468 沒μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制]，混勻，反應從加入1 mL PMS溶液[60 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制]開始，置室溫反應5 min，在紫外波長560 nm處測定各濃度樣品Ai值。各濃度樣品均重復以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對照，測定吸光度(A0)。以0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)調零。

公式：超氧陰離子清除率(%)=100×[A0-(Ai-Aj)]/A0

式中：A0為空白吸光值；Ai為樣品吸光值；Aj為樣品對照吸光值。

3 結果

3.1 優(yōu)化巴戟天醇提物的提取過程

3.1.1 乙醇濃度對巴戟天醇提物得率的影響 乙醇濃度在55 %～75 %的濃度范圍內，巴戟天的醇提物得率隨著乙醇濃度的升高而增大，在75 %處有最大得率，為7.17 %，但隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，得率沒有發(fā)生太大的變化。因而以下實驗中，選擇75 %的乙醇作為提取濃度進行提取。如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對巴戟天醇提物提取率的影響

3.1.2 提取溫度對巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著溫度的升高而增大，呈一定的量效關系，但是過高的溫度可能會使雜質的溶出度增加，破壞巴戟天抗氧化物的生物活性[16]，因而以下實驗中，選擇100 ℃為提取溫度進行提取。如圖2所示。

3.1.3 提取時間對巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著提取時間的改變，雖然時間越久，得率越高，但2 h后開始趨近于平穩(wěn)，時間越久需要耗費更多的財力物力，因而以下實驗中，因而選擇2 h作為提取時間進行提取。如圖3所示。

圖2 提取溫度對巴戟天醇提物提取率的影響

圖3 提取時間對巴戟天醇提物提取率的影響

3.2 巴戟天醇提物的抗氧化實驗

3.2.1 總抗氧化能力 鉬酸銨法通過配制H2SO4、Na3PO4和H8MoN2O4三種溶液，形成磷鉬復合物，使用紫外分光光度法通過測試溶液吸光度的變化，從而對抗氧化能力進行定量分析。由圖4可知，吸光度A在1 mg/mL處數(shù)值為1.134，吸光度隨著樣品濃度的增大而增大，說明巴戟天75 %醇提取物有一定的總抗氧化能力。如圖4所示。

圖4 巴戟天的總抗氧化能力

3.2.2 DPPH自由基清除能力 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是以N為中心，一種穩(wěn)定的有機自由基，在波長400～600 nm之間為中心處具有強烈的吸收，因此在溶液中呈現(xiàn)深紫色。與抗氧化劑單電子配對之后會褪色為無色或淺黃色，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當巴戟天75 %醇提取物濃度達到20 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率為48.016 %，說明巴戟天75 %醇提取物有清除DPPH自由基的能力。如圖5所示。

圖5 巴戟天對DPPH自由基的清除作用

3.2.3 還原力 還原力強的物質供應的電子可與自由基反應，使自由基成為穩(wěn)定的物質；當體系中存在還原性物質時，鐵氰化鉀會被還原成亞鐵氰化鉀，F(xiàn)e3+還原為Fe2+，該產物與三氯化鐵反應，生成普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3)，其在紫外波長700 nm處有最大吸收峰，抗氧化劑的還原能力越強，則測量的吸光度越大。因此其抗氧化活性的能力可根據還原力的大小來進行判斷。吸光度A隨著樣品濃度的增大而增大，呈量效關系，在10 mg/mL濃度下，吸光度為0.194，說明巴戟天75 %醇提取物含有抗氧化物質，具有一定的還原能力。見表1。

表1 巴戟天的還原能力

3.2.4 ABTS自由基清除作用 ABTS(2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)被過硫酸鉀氧化后，可生成藍綠色的陽離子自由基ABTS+，該自由基在紫外波長734 nm處有最大吸收峰。當抗氧化劑有清除該自由基的能力時，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當濃度在40 mg/mL時，清除率為8.858 %達到最高，說明巴戟天75 %醇提取物具有清除ABTS的活性，具有還原能力的物質存在。見表2。

表2 巴戟天對ABTS自由基的清除作用

3.2.5 超氧陰離子自由基清除作用 NBT(氯化硝基四氮唑藍)在560 nm處有最大吸收峰。當抗氧化劑有清除該自由基的能力時，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法對被測物質的還原能力進行定量分析。在1 mg/mL濃度條件下，巴戟天75 %醇提取物的清除率達到28.782 %，說明其對超氧陰離子有一定的清除作用，并且隨著樣品濃度的增大，清除率也跟著增大。見表3。

表3 巴戟天對超氧陰離子自由基的清除作用

4 討論

巴戟天作為福建本土的道地藥材，具有很高的藥用及經濟價值，對其的開發(fā)與利用一直是研究熱點。特別是近年來人們對人體健康的重視，從天然藥物中尋找抗氧化劑亦是一個研究的方向。自由基學說認為，生物體內多余的自由基會使機體器官產生衰退性變化。在正常情況下，生物體內自由基的產生與消除會達到一個動態(tài)平衡，但內源性的抗氧化物防御機制不足以應對由于衰老帶來的自由基，行之有效的辦法是通過補充體外抗氧化劑來減少生物體長期積累的氧化損傷[17]。實驗結果表明，巴戟天醇提物對ABTS自由基、超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，活性不是很顯著，但是能夠清除DPPH自由基，具有良好的總抗氧化能力和還原能力，表明巴戟天醇提部位存在清除自由基的物質，但還需要對其活性物質進一步的研究。細胞以及動物模型的測定值比體外化學提取法更具有生物相關性。為了能深入分析巴戟天活性物質在生物體內抗氧化的生物利用率及其物質基礎，后續(xù)還需要利用細胞模型和動物模型來做進一步的研究。