民族藥水三七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究

鄧 桃 楊昌貴 周 濤 江維克* 許 斌

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 貴陽 550002

水三七又名水田七、屈頭雞、水蘿卜等，為蒟蒻薯科植物裂果薯SchizocapsaplantagineaHance.的塊莖，水三七之名始載于《貴州衛(wèi)生》[1]，在《廣西中藥志》《湖南藥物志》中均有記載，主要分布于貴州、湖南、廣西等省區(qū)，為苗族、侗族、水族、瑤族等民族習(xí)用藥物，用于百日咳、食積、胃痛、跌打損傷、咽喉腫痛的治療[2]?，F(xiàn)代藥理和臨床應(yīng)用表明，水三七具有很好的抗腫瘤作用。2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和2014年版《廣西瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)中[3-5]均僅收載了水三七藥材的來源、性狀等簡單的質(zhì)控項(xiàng)目，缺少專屬的鑒別方法和藥效成分定量測定方法，這難以控制藥材質(zhì)量。因此，建立更為完善的水三七藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，顯得非常有必要。

水三七主要化學(xué)成分為甾族皂苷、氨基酸、黃酮和花青色素[6]以及多種甾苦味物質(zhì)[7]，其中總皂苷為其抗腫瘤的主要活性成分，能明顯抑制食管癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的生長[8-11]。因此，本文以總皂苷作為水三七含量測定的指標(biāo)成分。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[5,12]，對(duì)顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和總皂苷含量測定進(jìn)行研究，并對(duì)17批水三七藥材進(jìn)行測定，制定了合理的限度，為完善水三七質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了方法和依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑 紫外可見分光光度計(jì)(蘇州島津儀器有限公司，型號(hào)UV-2700)；型箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)SX-5-12)；電子分析天平(梅特勒科學(xué)儀器公司，型號(hào)EL104，分度值0.1 mg)。

人參皂苷Re對(duì)照品(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)52286-59-6，純度98 %)；冰醋酸(上海申博化工有限公司，批號(hào)1803101)、香草醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180510)、高氯酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170113)、甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20180802)、無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20180228)均為分析純。

1.2 藥材 水三七藥材采自貴州省羅甸、惠水、荔波、鎮(zhèn)遠(yuǎn)4縣的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室江維克教授鑒定為蒟蒻薯科植物裂果薯SchizocapsaplantagineaHance 的塊莖，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 粉末土黃色。淀粉粒類球形、半圓形、類三角形，直徑5～25 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、人字狀，復(fù)粒由2～3分粒組成；草酸鈣針晶散在或成束，長50～85 μm；螺紋導(dǎo)管可見，直徑8～30 μm。見圖1。

1、導(dǎo)管 2、淀粉粒 3、針晶圖1 水三七粉末顯微鑒別圖

2.2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的檢查及醇浸出物的含量測定 參照2015年版《中國藥典》第四部通則0832、2302測定水分、總灰分及酸不溶性灰分的含量；醇浸出物測定參照2015年版《中國藥典》四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法測定，以55 %乙醇為溶劑。所測17批藥材水分含量7.38%～8.79%，平均含量7.80%；總灰分含量3.26%～7.06%，平均含量3.89%；酸不溶性灰分含量0.45%～3.12%，平均含量0.72%；醇浸出物含量11.52%～22.32%，平均含量14.44%。結(jié)果見表3。

2.3 水三七總皂苷的含量測定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品18.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.744 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取水三七藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入70 %的乙醇25 mL，超聲處理90 min，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用提取液稀釋至刻度，即得。

2.3.3 顯色條件及檢測波長的選擇 分別精密量取0.2 mL“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品溶液于10 mL比色管中，90℃水浴蒸干溶劑，依次精密加入新配置的10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，搖勻，70℃水浴加熱20 min，取出，立即用水迅速冷卻至室溫，加冰醋酸5 mL，以隨行試劑為空白。在200 nm～800 nm范圍掃描，供試品和對(duì)照品均在545 nm處有最大吸收波長。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL，于10 mL比色管中，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測定各組吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.027843X+0.127869(r=0.9994)，表明人參皂苷Re在6.305 ～ 37.830 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取6份“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL于比色管在，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測定各組吸光度，RSD值為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取水三七藥材粉末6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色法測定吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，平均含量為2.70%，RSD值為2.39%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”下供試品溶液，分別于室溫0 h、0.5 h、1 h、2 h、14 h、18 h按“2.3.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，RSD值為1.75%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 人參皂苷Re的回收率

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的供試品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入2.23 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液3 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色法測定吸光度，計(jì)算回收率，回收率為95%～105%間，平均回收率為97.46%，RSD值為1.75%，結(jié)果見表2。

2.3.9 樣品檢測 取17批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測定各組吸光度，計(jì)算各批次樣品中總皂苷的含量，測定總皂苷含量1.39%～4.56%，平均含量為2.23%，RSD值為37.82%，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 浸出物的測定 研究表明，水三七醇浸出物具有較好的抗腫瘤效果[8]，控制醇浸出物的含量，對(duì)確保藥材質(zhì)量具有重要意義。本文考察了不同濃度的乙醇(55%、65%、75%、85%、95%)對(duì)浸出物含量的影響，發(fā)現(xiàn)55%乙醇作溶劑，浸出物的含量最高；比較了冷浸法和熱浸法的提取效果，發(fā)現(xiàn)熱浸法的提取效果較冷浸法好，且耗時(shí)短，故選擇以55%乙醇為提取溶劑，熱浸法測定含量。

3.2 總皂苷含量測定 水三七總皂苷為抗腫瘤的主要活性成分[9]，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，筆者對(duì)水三七總皂苷的提取工藝、顯色條件進(jìn)行了優(yōu)選。提取溶劑考察發(fā)現(xiàn)70%甲醇和70%乙醇的提取率相對(duì)較高，且二者差異不顯著，考慮到乙醇毒性較甲醇小，故選擇70%乙醇作為提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，考察了提取方法(超聲提取、回流提取)，提取時(shí)間(15～105 min)以及溶劑用量(10～70 倍量)對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果表明50倍量的70%乙醇超聲提取90 min可將總皂苷提取完全，所建立的供試品制備方法相較文獻(xiàn)報(bào)道的水浴回流4小時(shí)提取，不僅節(jié)約時(shí)間，而且提取率高、操作簡便。顯色條件考察了不同水浴揮干溫度(70℃、80℃、90℃)對(duì)總皂苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)揮干溫度對(duì)總皂苷含量無顯著性的影響，從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，把水浴揮干溫度定為90℃，相較于文獻(xiàn)用70℃揮干溶劑，極大的節(jié)約了時(shí)間。接著對(duì)顯色劑濃度和用量、顯色溫度及時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果表明采用10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，在70℃下水浴20 min顯色，能充分反應(yīng)，方法重復(fù)性良好。

3.3 限量標(biāo)準(zhǔn)制定 根據(jù)17批水三七藥材的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，水分、總灰分、酸不容性灰分按不高于平均值的120%制定標(biāo)準(zhǔn)限度，建議水分含量不得過9.0%，總灰分含量不得過5.0%，酸不溶性灰分含量不得過1.0%；浸出物、總皂苷按不低于平均值的80%制定標(biāo)準(zhǔn)限度，建議醇溶性浸出物含量不得少于12.0%，總皂苷含量以人參皂苷Re計(jì)，不得少于2.0%。

本文對(duì)水三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，相較于已有標(biāo)準(zhǔn)[3]，增加了“顯微鑒別”、“水分”、“總灰分及酸不溶性灰分”、“浸出物”和“含量測定”等項(xiàng)。且建立的質(zhì)量控制方法簡單易行，能夠準(zhǔn)確、科學(xué)地評(píng)價(jià)水三七質(zhì)量，為水三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了方法和依據(jù)。