類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者 TNF-α 表達水平及其基因 rs1800629 位點多態(tài)性分析

郭燕 劉小君 許海濤

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 ( rheumatoid arthritis，RA ) 是以炎性滑膜炎為主的一種慢性風(fēng)濕免疫性疾病，是中青年人群常見的一種自身免疫性疾病，全球人群發(fā)病率約為 1%～3%，且呈逐年上升趨勢。RA 是一種致殘性關(guān)節(jié)病，具有較高的致殘率，如不積極進行有效治療，約 50% 的 RA 患者在確診后 10 年內(nèi)將會喪失勞動能力[1-2]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3-7]，給家庭與社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，對 RA 進行早期診斷、治療及預(yù)防對提高治療效果、降低致殘率及預(yù)防 RA 的發(fā)生具有重要的意義。

RA 病因十分復(fù)雜，有研究表明 RA 發(fā)病與自身免疫、感染及遺傳等諸多因素有關(guān)，且與多種細(xì)胞因子及蛋白的表達水平異常有關(guān)[7-11]，其中遺傳基因突變在 RA 發(fā)生和發(fā)展中起了重要的作用。腫瘤壞死因子 ( tumor necrosis factor，TNF ) 是由巨噬細(xì)胞對免疫源反應(yīng)所產(chǎn)生的一種趨炎癥細(xì)胞因子，其水平高低與炎性反應(yīng)有密切相關(guān)，且 TNF 基因多個位點突變均可能影響 TNF 蛋白的表達。有研究表明，TNF 表達及其基因位點突變在 RA 發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用[12-14]。因此，本研究通過對 RA 患者和健康人群血清中 TNF 表達及其基因 rs1800629 位點的多態(tài)性進行了調(diào)查分析，旨在探索其與 RA 發(fā)病之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、研究對象

收集 2017 年 6 月至 2019 年 7 月來醫(yī)院診斷并確診為 RA 患者 152 例，其中男 59 例，女 93 例，年齡 31～65 歲，平均 ( 49.26±15.74 ) 歲。RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照 2010 美國風(fēng)濕病協(xié)會和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟 ( ACR / EULAR ) 分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，排除合并其它風(fēng)濕病 ( 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征及嚴(yán)重的膝骨關(guān)節(jié)炎 )、心腦血管、肝腎、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者及妊娠、哺乳期婦女和有精神異常者。同時選擇同期本區(qū)健康人群 107 例，其中男 31 例，女 76 例，年齡 29～66 歲，平均 ( 47.98±17.65 ) 歲，均無 RA 家族史、無 RA 早期及其它關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)，類風(fēng)濕因子 ( rheumatoid factor，RF ) 和抗環(huán)瓜氨酸肽 ( cyclic citmllinated peptide，CCP ) 抗體均陰性。確保兩組研究對象的年齡、性別等一般性資料比較具有可比性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)，同時經(jīng)同患者及家屬知情，并簽訂知情同意書。

二、儀器與試劑

ABI7500 PCR 基因擴增儀 ( 美國 ABI 公司提 供 )；DNA 提取試劑 ( 深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供 )；TNF-α 試劑盒 ( 深圳市科潤達生物工程有限公司提供 )；AE275 全自動免疫分析儀 ( 深圳愛康科技有限公司提供 )。

三、方法

1. 標(biāo)本采集：均于清晨采用一次性采血針采集研究對象空腹靜脈血 4～5 ml，其中 2 ml 加入 EDTA-K2 抗凝管內(nèi)混勻用于全血 DNA 提取，剩余的加入一次性無抗凝劑的干燥管內(nèi)，室溫靜置 30 min，然后于離心機內(nèi)離心分離血清，用于 TNF-α 水平測定。

2. TNF-α 水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法 ( enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA ) 檢測 TNF-α 水平，檢測前對相應(yīng)的儀器進行保養(yǎng)、校準(zhǔn)，并同時設(shè)置于質(zhì)控、空白及陰陽孔，待這些孔的光密度 ( optical density，OD ) 值均在有效值內(nèi)才對實驗結(jié)果進行判斷，否則要重復(fù)檢測。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書及科室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 ( standard operating procedure，SOP ) 操作規(guī)程進行。同時所有標(biāo)本檢測在相同條件下進行，確保檢測結(jié)果的可比性。

3. 全血 DNA 提?。喝?DNA 提取采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書進行，提取后 DNA 的濃度和純度采用紫外分光光度儀進行檢測，確保合格后置于 -20 ℃ 保存用于 TNF-α 基因多態(tài)性分析。

4. 多態(tài)性分析：( 1 ) 引物設(shè)計：TNF-α 基因 rs1800629 位點正向引物序列為 5'-TGT CAT TCA GTT CCC TCC TC-3'，反向引物序列為 5'-GAG CGT CTG CTG GCT GGG TG-3'；( 2 ) PCR 反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系為 25 μl，其中 DNA 模板 5 μl，Go Tag 混合酶 12.5 μl ( 包括 Taq DNA 聚合酶，dNTP，10×PCR緩沖液 )，正、反向引物各 0.25 μl，加入無菌去離子水至 25 μl 后混勻；( 3 ) PCR 擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，然后以 94 ℃ 45 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 45 s，共反復(fù)循環(huán) 35 次，最后 72 ℃ 延伸 10 min； ( 4 ) 限制性酶切：取 25 μl PCR 擴增的產(chǎn)物，加入 25 μl 限制性內(nèi)切酶 Nco I，1 μl 的 10×NEB 緩沖液，0.1 μl 的 100×牛血清白蛋白，用無菌去離子水加至 100 μl，混勻，于 65 ℃ 水浴 2 h；( 5 ) 電泳：取 10 μl 酶切產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳后判讀酶切結(jié)果。

5. 判讀標(biāo)準(zhǔn)：于 87 bp 和 20 bp 處出現(xiàn) 2 條電泳帶為 GG 的基因型，于 107 bp、87 bp 和 20 bp 處出現(xiàn) 3 條電泳帶為 GA 的基因型，僅于 107 bp 處出現(xiàn) 1 條電泳帶為 AA 的基因型。

6. 基因測序：隨機抽取部分 TNF-α 基因 rs1800629 位點 PCR 擴增產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司進行基因測序。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 5 軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率 ( % ) 表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組血清中 TNF-α 水平比較

RA 患者血清中 TNF-α 水平為 ( 39.16±11.05 ) pg / ml，明顯高于健康對照組的 ( 18.72±5.94 ) pg / ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t＝3.9524，P＜0.05 )。

二、兩組 TNF-α 基因 rs1800629 位點基因型及等位基因檢出率比較

RA 患者血清中 TNF-α 基因 rs1800629 位點的 GG 基因型和 G 等位基因檢出率分別為 71.72% 和 81.91%，明顯高于健康對照組的 24.30% 和 33.18%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2＝3.9547～5.0521，P＜0.05 ) ( 表1 )。

三、電泳結(jié)果

取 PCR 擴增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物于 2% 瓊脂糖凝膠電泳后 TNF-α 基因 rs1800629 位點可出現(xiàn) 3 種電泳結(jié)果：GG 基因型的 PCR 產(chǎn)物因含 Nco I 酶切位點，完全酶切，于 87 bp 和 20 bp 處出現(xiàn) 2 條電泳帶，GA 基因的 PCR 產(chǎn)物不完全酶切，于 107 bp、87 bp 和 20 bp 處出現(xiàn) 3 條電泳帶，而 AA 基因型的 PCR 產(chǎn)物不產(chǎn)生酶切，僅于 107 bp 處出現(xiàn) 1 條電泳帶，結(jié)果見圖1。

四、PCR 擴增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果

對 TNF-α 基因 rs1800629 位點 PCR 擴增產(chǎn)物進行抽樣部分基因測序，結(jié)果見圖2、3。

五、不同基因型 RA 患者血清中 TNF-α 水平 比較

攜帶 GG 基因型 RA 患者血清中 TNF-α 水平為 ( 48.19±15.03 ) pg / ml，明顯高于 GA 和 AA 基因型的 ( 34.25±9.85 ) pg / ml 和 ( 26.57±7.02 ) pg / ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t＝2.8472～3.5165，P＜0.05 )。

表1 RA 組和對照組 TNF-α 基因 rs1800629 位點基因型及等位基因檢出率比較 [ n ( % ) ]Tab.1 Comparison of genotypes and allele detection rates of TNF- gene rs1800629 in RA group and control group [ n ( % ) ]

圖1 TNF-α 基因 rs1800629 位點 PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖 ( a：AA 基因型；b、e：GG 基因型；c、d：GA 基因型；Marker：標(biāo)記物 )Fig.1 Electrophoresis of the PCR product from TNF-gene rs1800629 ( a: AA genotype; b, e: GG genotype; c, d: GA genotype; Marker: the marker )

圖2 TNF-α 基因 rs1800629 位點 GG 基因型反向測序圖Fig.2 Reverse sequencing of GG genotype of TNF- gene rs1800629

圖3 TNF-α 基因 rs1800629 位點 GA 基因型反向測序圖Fig.3 Reverse sequencing of GA genotype of TNF- gene rs1800629

討 論

TNF-α 是由巨噬細(xì)胞對細(xì)菌感染或其它免疫源反應(yīng)自然產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，也可由 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞在某些刺激因子如丙二醇甲醚醋酸酯 ( propylene glycol methyl ether acetate，PMA ) 誘導(dǎo)下而產(chǎn)生。TNF-α 主要功能是殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞，促進中性粒細(xì)胞吞噬，促進髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，促進細(xì)胞增殖和分化，并參與某些自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，TNF-α 能通過激活 NF-KB 和 JNK 信號通路，誘導(dǎo)黏附分子表達、吸引和激活機體內(nèi)中性粒細(xì)胞，形成吞噬免疫復(fù)體，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生，并誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌膠原酶和前列腺素 E-2，形成類風(fēng)濕性血管翳而參與 RA 發(fā)病，其水平在 RA 患者血清中明顯升 高[15-16]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū) RA 患者血清中 TNF-α 水平明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，與施利青等[17]和梁朝洋[18]報道的基本一致，這可能與 RA 患者受累的關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)存在大量炎癥細(xì)胞浸潤，這些細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子有關(guān)。

RA 發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展及對該疾病不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)多種基因位點多態(tài)性突變均可能增加 RA 發(fā)病的易感性，與 RA 疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷具有顯著相關(guān)性[19-20]。TNF-α 位于人體 6 號染色體短臂上的 TNF 基因編碼，TNF 基因位于 HLA-III 區(qū)域，在 HLA-I 和 HLA-II 區(qū)域之間，由 157 個氨基酸殘基組成，分子量為 17 kDa。有研究表明，TNF-α 基因啟動子區(qū)域上多個位點突變與 RA 發(fā)病有關(guān)，且 TNF-α 基因位點突變存在區(qū)域性和種族性，如 Song 等[21]研究發(fā)現(xiàn)拉丁美洲人群中 TNF-α 基因 rs1800629 位點基因突變與 RA 發(fā)病有顯著相關(guān)性，而在亞洲、歐洲及阿拉伯人群中沒發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，但李芬等[12]報道 TNF-α 基因 rs1800629 位點突變與湖南地區(qū) RA 發(fā)病有關(guān)，而 Aranda 等[22]報道與 RA 無相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū) RA 患者血清中 TNF-α 基因 rs1800629 位點 GG 基因型和 G 等位基因檢出率明顯高于對健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，這表明 TNF-α 基因 rs1800629 位點突變可能與本地區(qū) RA 發(fā)病有密切相關(guān)，且攜帶 GG 基因型的 RA 患者血清中 TNF-α 水平明顯高于其它基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，這可能與 TNF-α 基因 rs1800629 位點突變導(dǎo)致炎癥細(xì)胞分泌 TNF-α 能力增強有關(guān)。

綜上所述，RA 患者血清中 TNF-α 水平明顯升高，TNF-α 基因 rs1800629 位點 GG 基因型和 G 等位基因檢出率明顯高于對健康人群，且攜帶 GG 基因型的 RA 患者血清中 TNF-α 水平明顯高于其它基因型，表明 TNF-α 基因 rs1800629 位點突變可能與深圳地區(qū) RA 發(fā)病有一定的相關(guān)。