血清miRNA-195作為帕金森病潛在生物學(xué)標(biāo)記物的初步研究

陳子旋?朱麗娜?劉雯?解孝艷　楊厲穎　周靜雯　徐將　劉姜冰　王英歌　唐向明

【摘要】背景近年來(lái)有研究表明血清微小RNA（microRNA，miRNA）可作為疾病生物學(xué)標(biāo)志物，有助于疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷以及監(jiān)測(cè)治療效果和預(yù)后。本研究對(duì)一種血清miRNA與帕金森?。≒D）相關(guān)性進(jìn)行探究，力求尋找PD早期診斷可能的生物學(xué)標(biāo)志物。 目的 研究末梢血清miRNA作為帕金森病生物標(biāo)志物的潛力。 方法 采集36例PD患者和36例健康體檢者血清標(biāo)本，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)血清內(nèi)miR-195的表達(dá)。收集211例PD患者和113例健康人臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果與健康體檢者相比，PD患者血清miR-195表達(dá)水平明顯上調(diào)。臨床統(tǒng)計(jì)資料分析顯示吸煙、糖尿病與PD發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，高血壓可能與PD發(fā)病呈正相關(guān)，PD病人伴有外周血紅細(xì)胞及血紅蛋白量降低。

【關(guān)鍵詞】帕金森?。≒D）;血清;miRNA;生物標(biāo)記物;危險(xiǎn)因素

【中圖分類號(hào)】R37 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2020.18..02

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失為病理特征。PD臨床運(yùn)動(dòng)癥狀有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直以及姿勢(shì)步態(tài)障礙等，非運(yùn)動(dòng)癥狀包括認(rèn)知障礙、嗅覺喪失、便秘等。多數(shù)患者的非運(yùn)動(dòng)癥狀較運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)早，PD的診斷主要依賴于臨床運(yùn)動(dòng)癥狀。影像學(xué)早期無(wú)典型特征[1]，缺乏特異性生物學(xué)標(biāo)志物，導(dǎo)致PD早期診斷困難。所以尋找特異性較高的生物學(xué)標(biāo)記物是PD早期診斷的重要問(wèn)題。為尋找PD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記物，大量學(xué)者對(duì)腦脊液，血漿，血清，唾液，尿液，皮膚等組織標(biāo)本進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血清中循環(huán)RNA作為生物學(xué)標(biāo)記物具有優(yōu)勢(shì)。盡管大量研究對(duì)PD患者血清中miRNA進(jìn)行探索，結(jié)果卻存在異質(zhì)性。Aghili[2]制作出miR-195電化學(xué)納米生物傳感器用于早期診斷PD，其敏感性和特異性需進(jìn)一步證實(shí)。本研究旨在探索外周循環(huán)血清miR-195與PD發(fā)病的相關(guān)性，為PD的早期識(shí)別提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)自2018年5月～2019年10月收集揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院72個(gè)漢族個(gè)體血液，所有受試者均已簽署知情同意書。帕金森病的診斷依據(jù)典型臨床癥狀和體征以及影像學(xué)確診，主要排除標(biāo)準(zhǔn)包括PD病人合并腫瘤、惡液質(zhì)、全身或中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重感染;伴有心、肝、腎或其他臟器嚴(yán)重疾病的病史。另收集211個(gè)帕金森患者和113個(gè)正常體檢者的臨床資料進(jìn)行分析。這項(xiàng)研究得到了揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

采集空腹安靜狀態(tài)下PD病人和健康者血液，離心取上清液至-80°C貯存。使用miRNA提取分離試劑盒（北京天根）提取小分子RNA。血清中提取出的RNA使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)液可于-20°C保存。進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)前，將cDNA反應(yīng)液加入4倍DEPC水稀釋使用。使用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（北京天根）、SYBR、miR-195引物和內(nèi)參U6，配置20ul體系試劑，使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（羅氏LightCycler480）檢測(cè)。樣本一式兩份進(jìn)行，最終miRNA表達(dá)量計(jì)算為2-ΔΔCt。

2 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品SPSS16.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中miR-195表達(dá)量通過(guò)獨(dú)立t檢驗(yàn)，臨床數(shù)據(jù)通過(guò)x2檢驗(yàn)和獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)測(cè)量和分析了miRNA-195（CT值，7.296±1.42774）的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PD病人血清中miRNA-195（P=0.001）表達(dá)量明顯高于健康人，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床收集的211例PD患者中，男性121例，女性90例，年齡處于72.76±8.47歲。臨床數(shù)據(jù)結(jié)果由表可知高血壓可促進(jìn)PD進(jìn)展，糖尿病、吸煙不增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。PD患者較健康人群外周血紅細(xì)胞和血紅蛋白含量降低。見下表

4 討 論

目前大部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷主要依靠臨床癥狀和影像學(xué)檢查，這使得該類疾病的早期防治策略的開發(fā)受到限制。目前已發(fā)現(xiàn)多種血清miRNAs可作為PD診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。Barbagallo等人[3]對(duì)139例神經(jīng)退行性疾病患者和健康人血清中23種miRNAs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs的分泌具有特異性，從而可用于神經(jīng)退行性疾病的無(wú)創(chuàng)診斷。本研究測(cè)得miR-195在PD患者血清表達(dá)上調(diào)，與馬文斌[4]，曹向陽(yáng)[5]研究結(jié)果一致。Aghili等人[2]制作出miR-195電化學(xué)納米生物傳感器用于早期診斷PD，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明其可行性。本研究具有一定的局限性，收集血清樣本均來(lái)自漢族72位個(gè)體，是否適用于其他種族仍需進(jìn)一步探究，且樣本量有待進(jìn)一步擴(kuò)大。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、吸煙與PD發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，這與夏虹等人[6]使用meta分析結(jié)果一致。腦內(nèi)胰島素調(diào)節(jié)受損與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)改變具有相關(guān)性[7]，這為糖尿病在PD中的不同作用提供了依據(jù)。高血壓與PD的發(fā)生發(fā)展密不可分。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果證明PD患者血中紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)量減低。目前有研究提示鐵代謝紊亂造成的貧血可作為促進(jìn)PD病理進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，而外周血中高氧化應(yīng)激狀態(tài)和紅細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白的聚集可能加重對(duì)外周血紅細(xì)胞的破壞作用[8]。

miRNA作為PD早期識(shí)別生物學(xué)標(biāo)志物的臨床意義包括阻礙和延緩癥狀的發(fā)生，前移PD康復(fù)治療的時(shí)間窗，幫助病人做到提前干預(yù)，在指導(dǎo)康復(fù)治療中起到輔助作用。盡管血清中的一些microRNAs可以作為潛在的帕金森病生物學(xué)標(biāo)記物，但距離應(yīng)用于臨床診斷仍有很大距離。目前臨床對(duì)早期帕金森病的誤診率高達(dá)25%，多在神經(jīng)元損傷后5～15年內(nèi)方可確診，臨床更多目光聚焦于帕金森病的康復(fù)治療。目前康復(fù)治療方法多種多樣，但均需要針對(duì)個(gè)別患者特征制定不同的康復(fù)計(jì)劃。運(yùn)動(dòng)影像和動(dòng)作觀察療法、虛擬現(xiàn)實(shí)、耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、力量訓(xùn)練，有氧訓(xùn)練和物理療法被認(rèn)為是有前途的PD康復(fù)方法。另外，負(fù)責(zé)神經(jīng)功能障礙康復(fù)的Lokomat機(jī)器人常應(yīng)用于帕金森疾病康復(fù)治療，使患者運(yùn)動(dòng)能力得到改善[9][10][11]。隨著科技和醫(yī)療的發(fā)展，PD的康復(fù)治療將會(huì)有更多的進(jìn)展，這也將為PD患者帶來(lái)更多有效的治療方案。

5 結(jié) 論

血清miRNA-195可能作為帕金森病診斷的生物學(xué)標(biāo)記物，目前需要更多的研究來(lái)證實(shí)。吸煙、糖尿病與PD發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，高血壓、貧血是PD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。帕金森病無(wú)法達(dá)到治愈目的，臨床注重PD患者的康復(fù)治療。

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