葛根淀粉提取工藝優(yōu)化與同時富集回收總異黃酮的方法

李漪錦 肖力 徐夢瑋

摘要：旨在采用勻漿法優(yōu)化葛根淀粉提取工藝并同時利用大孔吸附樹脂富集回收其水提液中的總異黃酮。通過單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化葛根淀粉的提取條件，同時考察葛根總異黃酮的溶出效果，最后用大孔樹脂吸附法富集回收勻漿提取液中的總異黃酮。結(jié)果表明，用勻漿法提取葛根淀粉的最佳工藝條件為液料比8 mL ∶ 1 g、勻漿時間30 s，洗滌時的液料比為6 mL ∶ 1 g，在此條件下淀粉的收率為（18.58±0.26）%（n=3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差=1.38%），總異黃酮在水中的溶出率為（1.49±0.05）%（n=3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差=3.37%）。D101大孔樹脂對葛根總異黃酮的動態(tài)飽和吸附容量可以達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%，樣品中的總異黃酮含量（紫外比色法）可以達(dá)到50.91%，其中葛根素的含量（高效液相色譜法）為28.77%。該研究方法操作簡單易行，提取溶劑價格低廉且環(huán)保，淀粉、總異黃酮的收率都較高，回收的總異黃酮純度也較高，減輕了葛根淀粉提取加工過程中排放水對環(huán)境的污染，高效合理利用了葛根資源，能夠?yàn)橹行⌒透鸶庸て髽I(yè)對葛根淀粉的提取加工及資源化綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葛根;淀粉;總異黃酮;葛根素;勻漿法

葛根（Radix Puerariae）是豆科植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]或甘葛藤[Pueraria thomsonii Benth.]的干燥根，為常用的傳統(tǒng)中藥，其性味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉的功效[1]。葛根藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，被列為中品。我國葛屬植物資源豐富，目前發(fā)現(xiàn)9個品種和2個變種，應(yīng)用最多的是野葛和粉葛，其中粉葛淀粉含量豐富（含粉率一般為20%～25%），但是異黃酮含量相對于野葛而言并不高，多用于提取淀粉。野葛異黃酮含量較高而淀粉含量較低，因此對其活性成分異黃酮的研究較多[3-4]。目前，從葛根中分離鑒定的異黃酮類化合物多達(dá)幾十種，主要為葛根素，還有大豆素、大豆苷、染料木素、芒柄花素等。葛根異黃酮具有植物雌激素樣作用及擴(kuò)張冠脈血管等心血管相關(guān)作用，還具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等活性[5-10]，因而受到人們的廣泛關(guān)注。葛根素為葛根中特有的異黃酮，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、眼底疾病、急性乙醇中毒及腫瘤的治療[11-13]。

葛根是國家衛(wèi)生健康委員會批準(zhǔn)的藥食兩用植物，野葛淀粉在我國民間的食用歷史悠久。但是長期以來我國葛根資源的開發(fā)呈現(xiàn)顧此失彼的狀況，僅限于對淀粉或者黃酮類化合物中單一成分的利用，造成了資源的浪費(fèi)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來我國開始出現(xiàn)部分中小型葛根淀粉生產(chǎn)加工企業(yè)，但一般采用傳統(tǒng)工藝[14-15]。為了獲得色澤潔白的葛根淀粉，常需要多次漂洗與沉降，存在用水量大、僅利用了其中的淀粉而對生產(chǎn)過程中的勻漿提取液并未加以回收利用便直接外排，這樣不僅會對環(huán)境造成較大污染，而且會造成異黃酮資源的巨大浪費(fèi)。近年來，人們認(rèn)識到在生產(chǎn)葛根淀粉的同時回收利用異黃酮成分的重要性，提出了醇提工藝[16-17]，但是以乙醇替代水作為溶劑提取和生產(chǎn)葛根淀粉，必然導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜、設(shè)備投入大、生產(chǎn)成本偏高等問題，不適合中小型加工企業(yè)的生產(chǎn)要求。本研究旨在優(yōu)化大部分中小型葛根生產(chǎn)企業(yè)在葛根淀粉提取加工中采用的勻漿法這一傳統(tǒng)加工工藝，以期減少生產(chǎn)中的用水量，同時考察葛根異黃酮的溶出情況，并以大孔樹脂吸附法富集回收加工葛根淀粉所產(chǎn)生的排放水中的總異黃酮，從而為葛根資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 葛根材料為粉葛，種植時間為2年，購自張家界越天然農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司;葛根素標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號：110752-201615），購自中國食品藥品鑒定研究院;D101大孔樹脂，購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;試驗(yàn)用水為純凈水;其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;LC-20AT高效液相色譜（HPLC）儀，日本島津公司;ATY124萬分之一電子天平，日本島津公司;TP-520A千分之一電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司;攪拌機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司;TG16-WS高速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葛根淀粉的生產(chǎn)工藝及方法 葛根淀粉的生產(chǎn)工藝流程如下：鮮葛根→清洗→去皮→切片→勻漿→過濾→洗滌→沉降→干燥。具體方法：將鮮葛根用自來水洗凈、去皮，切成0.2 mm左右的薄片;稱取50 g薄片放入攪拌機(jī)中，加入適量純凈水，啟動電源勻漿一定時間;用3層紗布過濾勻漿，殘?jiān)眠m量純凈水分次洗滌，收集濾液，即為勻漿法制備得到的提取液（目前此提取液在實(shí)際生產(chǎn)中被大部分中小型葛根加工廠當(dāng)作廢水向外直接排放）;將濾液靜置沉降24 h后傾出上清液，收集上清液（用于總異黃酮的富集與回收）;沉淀用100 mL純凈水清洗1次，進(jìn)行二次沉淀，傾去上清液，將淀粉在70 ℃烘干至恒質(zhì)量，取出淀粉，在千分之一電子天平上稱質(zhì)量。按公式（1）計(jì)算淀粉收率：

1.2.2 單因素試驗(yàn)條件 考察勻漿過程中的液料比（2 mL ∶ 1 g、4 mL ∶ 1 g、6 mL ∶ 1 g、8 mL ∶ 1 g、10 mL ∶ 1 g、12 mL ∶ 1 g）、勻漿時間（30、60、90、120、150 s）、洗滌過程中的液料比（0 mL ∶ 1 g、1 mL ∶ 1 g、2 mL ∶ 1 g、3 mL ∶ 1 g、4 mL ∶ 1 g、5 mL ∶ 1 g、6 mL ∶ 1 g、7 mL ∶ 1 g、8 mL ∶ 1 g）對葛根淀粉收率及總異黃酮收率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以淀粉、總異黃酮的收率為考察指標(biāo)，對勻漿過程中的液料比、勻漿時間及洗滌過程中的液料比進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)L9（33），因素與水平設(shè)置見表1。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)的優(yōu)選條件進(jìn)行3個平行試驗(yàn)。

1.2.5 勻漿提取液中總異黃酮的回收 按照上述優(yōu)選條件提取淀粉，沉降24 h。傾出上清液并將上清液于9 000 r/min離心處理5 min，收集離心液。離心液用D101大孔樹脂以1 BV/h的流速上柱動態(tài)吸附，吸附總異黃酮的樹脂先用2 BV的純凈水洗去殘留液，再用6 BV的70%乙醇以1 BV/h的流速洗脫。收集洗脫液，回收乙醇至干，即可得到總異黃酮樣品。

1.2.6 總異黃酮與葛根素含量的測定

1.2.6.1 紫外（UV）比色法測定總異黃酮含量 由于葛根異黃酮在250 nm處的紫外吸收特征峰與葛根素相似，因此在用UV比色法測定葛根中總異黃酮含量的過程中可以采用葛根素作為對照品，具體操作步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取6.0 mg葛根素標(biāo)樣于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，將其定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容、搖勻。分別移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容、搖勻。用紫外-可見分光光度計(jì)在250 nm波長下測定吸光度，繪制總異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的分析。將液體樣品作適當(dāng)稀釋后直接采用UV比色法測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出待測液中的總異黃酮濃度C1，同時可以按照以下公式計(jì)算出樣品中的總異黃酮含量：

1.2.6.2 HPLC法分析總異黃酮樣品中的葛根素含量 HPLC條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相A為純凈水，流動相B為甲醇。梯度洗脫條件如下：00.00～25.00 min，30%～70% B;25.00～25.10 min，70%～100% B;25.10～27.00 min，100% B;27.00～34.00 min，30% B。流速為0.80 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為250 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制葛根素質(zhì)量濃度為 1.747～57.576 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述色譜條件檢測后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度的測定：準(zhǔn)確稱取10 mg分離樣品于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。按照上述色譜條件進(jìn)行測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中葛根素的濃度。按公式（3）計(jì)算葛根素含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 UV比色法分析樣品中的總異黃酮含量

通過紫外-可見分光光度法，在250 nm處依次測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。結(jié)果表明，總異黃酮的質(zhì)量濃度在2.4～19.2 mg/L范圍內(nèi)時，其質(zhì)量濃度（x）與吸光度（y）具有很好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.016 2+59.048 96x（r=0.999 8，n=5）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 勻漿時間對淀粉、總異黃酮收率的影響 固定勻漿過程中的液料比及洗滌過程中的液料比，研究勻漿時間對淀粉及總異黃酮收率的影響。從圖1可看出，勻漿時間為60 s時，淀粉及總異黃酮收率均已達(dá)到較高水平。由于勻漿時間過長時，勻漿時會產(chǎn)生大量泡沫，給后續(xù)的過濾水洗淀粉工作帶來困難，因此，本研究選擇的勻漿時間為60 s。

2.2.2 勻漿過程中液料比對淀粉、總異黃酮收率的影響 在勻漿時間一定、固定洗滌過程中液料比的條件下，研究勻漿過程中液料比對淀粉、總異黃酮收率的影響。從圖2可以看出，隨著液料比的增大，

淀粉與總異黃酮的收率均呈現(xiàn)先升高后略有降低的趨勢;當(dāng)液料比為6 mL ∶ 1 g時，淀粉收率最高;當(dāng)液料比為8 mL ∶ 1 g時，總異黃酮收率最高。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中的用水成本，最后選擇勻漿過程中的液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.2.3 沖洗過程中液料比對淀粉和總異黃酮收率的影響 在勻漿時間及勻漿過程中液料比一定的條件下，研究洗滌過程中液料比對淀粉、總異黃酮收率的影響。從圖3可以看出，在沖洗過程中，隨著液料比增大，淀粉收率也提高，當(dāng)液料比大于 6 mL ∶ 1 g 時，淀粉收率的變化不明顯，即吸附在殘?jiān)系牡矸垡呀?jīng)被水沖洗干凈;在洗滌過程中，當(dāng)液料比≥3 mL ∶ 1 g時，總異黃酮收率基本保持不變。由于水量增加時，會導(dǎo)致企業(yè)的生產(chǎn)成本增加和排放水處理工作量增大，因此，綜合考慮后選擇的液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.3 正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化勻漿法提取淀粉、總異黃酮的條件，對勻漿過程中的液料比、洗滌過程中液料比及勻漿時間進(jìn)行3因素3水平的L9（33）正交試驗(yàn)。從表2可見，3個因素對淀粉收率影響的排序?yàn)锽（洗滌液料比）>C（勻漿時間）>A（勻漿用液料比）。對于總異黃酮的收率而言，勻漿液料比的影響最大。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以2年生栽培粉葛為原料，用勻漿法提取淀粉的最佳工藝條件為A3B2C1，即勻漿用液料比為8 mL ∶ 1 g，洗滌液料比為6 mL ∶ 1 g，勻漿時間為30 s;用勻漿法以水為溶劑提取總異黃酮的最佳工藝條件為A1B3C2，即勻漿用液料比為 5 mL ∶ 1 g，洗滌過程中的液料比為 7 mL ∶ 1 g，勻漿時間為60 s。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于葛根淀粉生產(chǎn)中的總異黃酮僅為回收利用，故按上述淀粉提取的優(yōu)選條件進(jìn)行3個平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，3次平行試驗(yàn)中，淀粉收率分別為18.29%、18.77%、17.69%，平均值為（18.58±0.26）%（n=3，RSD=1.38%），此時總異黃酮在水中的溶出率分別為1.54%、1.44%、1.50%，平均值為（1.49±0.05）%（n=3，RSD=3.37%）。說明用優(yōu)選條件提取葛根淀粉是可行的，同時對總異黃酮的溶出效果也是穩(wěn)定的。

2.5 勻漿提取液中總異黃酮的回收

沉降分離淀粉后，水中含有較高含量的葛根素及其他異黃酮，其中葛根異黃酮具有重要的生物活性，用途廣泛，而葛根素已被廣泛應(yīng)用于生物制藥中。因此，將工業(yè)生產(chǎn)過程中沉降淀粉后的水直接排放，不僅會污染環(huán)境，而且會造成異黃酮資源的巨大浪費(fèi)。本研究用D101大孔樹脂吸附排放水中的異黃酮，再用6 BV的70%乙醇以1.0 BV/h的流速洗脫吸附在樹脂上的異黃酮，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收洗脫液中的乙醇至干，得到葛根總異黃酮樣品。用UV比色法分析樣品中的總異黃酮含量，結(jié)果表明，D101大孔樹脂對葛根總異黃酮的動態(tài)飽和吸附容量可達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%，樣品中的總異黃酮含量可達(dá)50.91%。

采用HPLC法檢測并分析用大孔樹脂富集回收所得總異黃酮樣品中的葛根素含量，用HPLC法對葛根素標(biāo)準(zhǔn)對照樣品（保留時間為11.63 min）及總異黃酮樣品進(jìn)行分析檢測。如圖4所示，葛根素質(zhì)量濃度（x）在1.747～57.576 mg/L范圍內(nèi)時，與積分面積（y）具有良好線性關(guān)系：y=29 348.4x-841.565，r2=0.999 6（n=7）。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，用D101大孔樹脂富集回收得到的總異黃酮樣品中葛根素的含量為28.77%。

3 討論

通過單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對勻漿法提取葛根淀粉及其總異黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用大孔吸附樹脂富集了勻漿提取液中的總異黃酮。結(jié)果表明，在勻漿液料比為8 mL ∶ 1 g、洗滌液料比為 6 mL ∶ 1 g、勻漿時間為30 s的條件下提取淀粉，淀粉收率為（18.58±0.26）%（n=3，RSD=1.38%），此時總異黃酮的溶出率為（1.49±0.05）%（n=3，RSD=3.37%）。D101大孔樹脂對葛根總異黃酮的動態(tài)飽和吸附容量可達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收洗脫液中的乙醇至干，所得樣品中的總異黃酮含量可達(dá)到50.91%（UV比色法），葛根素含量為28.77%（HPLC法）。

葛根為常用中藥材，葛根素在臨床上用于治療心腦血管等疾病，主要藥用成分為葛根素等異黃酮類化合物，此外葛根中還有高含量的淀粉。葛根對生長的環(huán)境要求不高，耐貧瘠，耐干旱，適合在山區(qū)種植。近年來，葛根種植與淀粉加工已經(jīng)成為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的一條重要途徑。一些地區(qū)小型淀粉加工廠多，在技術(shù)上僅利用了葛根淀粉，這不僅造成葛根素等異黃酮資源的巨大浪費(fèi)，而且在葛根淀粉加工過程中排放的水也對環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的污染。因此，中小型葛根加工企業(yè)可以在生產(chǎn)實(shí)際中大力推廣采用勻漿法優(yōu)化后的葛根淀粉提取工藝，同時利用大孔吸附樹脂富集回收其水提液中總異黃酮的方法。這一生產(chǎn)工藝既符合國家的綠色發(fā)展戰(zhàn)略，又可以高效合理利用葛根資源，不僅能夠從生產(chǎn)源頭防止企業(yè)對環(huán)境造成污染，而且可以為企業(yè)增加經(jīng)濟(jì)收益。

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