東北對(duì)開(kāi)蕨孢子離體快繁技術(shù)研究

韓汶雨 劉建星 徐鈺童 陳浩宇 于海闊

【摘? ?要】 該實(shí)驗(yàn)以東北對(duì)開(kāi)蕨的孢子為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，得出了東北對(duì)開(kāi)蕨孢子離體快繁的途徑：孢子試管培養(yǎng)初步得出原葉體，原葉體通過(guò)擴(kuò)繁數(shù)量增多，然后將這些原葉體進(jìn)行試管外誘導(dǎo)得到孢子體，培養(yǎng)孢子體即可得到東北對(duì)開(kāi)蕨的植株。另通過(guò)配方比較得出：試管內(nèi)采用MS培養(yǎng)基增殖效果最好，試管外培養(yǎng)過(guò)程中定期噴施0.1% KH2PO4誘導(dǎo)劑效果最好。

【關(guān)鍵詞】 孢子;東北對(duì)開(kāi)蕨;原葉體增殖;孢子體誘導(dǎo)

東北對(duì)開(kāi)蕨，拉丁學(xué)名：Phyllitis scolopendrium （L.） Newm.，又稱(chēng)日本對(duì)開(kāi)蕨、長(zhǎng)白對(duì)開(kāi)蕨、東北對(duì)開(kāi)蕨等，為鐵角蕨科對(duì)開(kāi)蕨屬中的一種野生蕨類(lèi)植物。該植物高約60 cm，根狀莖短而直立或斜生，葉柄基部密被鱗片;葉常見(jiàn)3-8枚簇生，葉柄長(zhǎng)10-20cm，葉柄顏色呈棕色至褐棕色，柄上分布著稀疏的鱗片，葉片形狀為舌狀、披針形，長(zhǎng)30cm左右，端部漸尖;葉子在鮮艷的時(shí)候呈肉質(zhì)，干后薄革質(zhì)，棕綠色，上面光滑，葉子干后在側(cè)脈之間有明顯的洼點(diǎn);東北對(duì)開(kāi)蕨的孢子囊群粗線形，通常長(zhǎng)1.5-2.5 cm，著生于相鄰兩小脈的一側(cè)。東北對(duì)開(kāi)蕨是世界稀有植物，我國(guó)1975年9月于長(zhǎng)白山發(fā)現(xiàn)，填補(bǔ)了對(duì)開(kāi)蕨在我國(guó)的空白，具有較高的研究?jī)r(jià)值。東北對(duì)開(kāi)蕨是一種非常具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥用植物，目前在醫(yī)藥上用做泌尿系統(tǒng)的消炎、利尿、消腫、止血?jiǎng)┑?，其藥效藥理還有待進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)。東北對(duì)開(kāi)蕨繁殖系數(shù)不高，為陰性植物，養(yǎng)護(hù)過(guò)程中要求濕度較大，管理成本高，因此本研究嘗試進(jìn)行東北對(duì)開(kāi)蕨的孢子離體快繁，以提高繁殖速度和降低育苗成本。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

材料取自吉林市園林處第一苗圃溫室大棚，于2019年8月23日采集東北對(duì)開(kāi)蕨孢子，由于孢子位于孢子囊中，采集時(shí)將含有成熟孢子囊的孢子葉一起進(jìn)行采集。采集當(dāng)天直接帶回組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行孢子葉的切割，孢子葉呈1cm大小。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子接種? 收集所有切割的孢子葉先放入0.1%的升貢（HgCl2）溶液中消毒8 min，清洗后用干濾紙吸掉孢子葉上的水分，放在超凈臺(tái)解剖鏡下切割分離孢子，先將孢子囊從孢子葉上分離開(kāi)來(lái)，然后放在提前裁剪好的濾紙上，濾紙裁剪大小為2cm2。用鑷子緊壓孢子囊，孢子囊破裂露出孢子，然后將小塊濾紙及粘附的孢子一起接種到初代培養(yǎng)基上。初代培養(yǎng)基配方采用1/2MS（其中添加糖20g/L，瓊脂6g/L），接種50瓶。

1.2.2 原葉體增殖培養(yǎng)? 孢子接種后，逐步會(huì)在1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，待分化出原葉體團(tuán)且長(zhǎng)成1cm大小時(shí)，在超凈臺(tái)下取出分割，切成徑約0.2cm小塊接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，擴(kuò)繁采用200 mL組培瓶，每瓶分散接種10塊。增殖培養(yǎng)基采用10個(gè)配方配比，配方均添加糖為15 g/L，瓊脂 6g/L。培養(yǎng)室溫度設(shè)定25℃，濕度85%，光強(qiáng)1000 Lx，光照時(shí)間12h/d。

1.2.3 誘導(dǎo)孢子體? 原葉體增殖長(zhǎng)到1 cm左右時(shí)，從容器中取出切成0.1 cm小塊，將原葉體小塊進(jìn)行試管外培養(yǎng)以誘導(dǎo)出孢子體。試管外誘導(dǎo)采用盆栽方式，以草炭：蛭石=1：1的比例混合作為基質(zhì)，放入溫室進(jìn)行培養(yǎng)。在誘導(dǎo)孢子體階段噴施3種不同的誘導(dǎo)劑，以比較最佳的誘導(dǎo)劑。溫室溫度20-25℃，盆栽覆膜遮蔭，保證盆內(nèi)光強(qiáng)500Lx-1000Lx，遮陰率60%。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 原葉體增殖情況

由表1可以看出，10個(gè)配方配比經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后均增殖出原葉體，增殖倍數(shù)均大于4.5，說(shuō)明以MS或1/2MS作為基本培養(yǎng)基起到了促進(jìn)分化擴(kuò)繁的作用。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般在增殖階段添加細(xì)胞分裂素可以提高增殖的效果，因此該試驗(yàn)在MS配方中分別添加了不同量的 KT和6-BA，但根據(jù)表1可以看出，添加細(xì)胞分裂素的效果并不明顯。10個(gè)配方中增殖原葉體數(shù)最多的為MS基本培養(yǎng)基，而它的接種數(shù)為31，并不高于其他配方，它的增殖倍數(shù)為5.5，增殖得出的葉原體生長(zhǎng)也較好，大而且平展?？傮w比較得出：在原葉體增殖階段直接采用MS基本培養(yǎng)基就能取得良好的效果，不必要添加植物激素。

2.2? 孢子體誘導(dǎo)情況

進(jìn)行原葉體誘導(dǎo)目的是為了得到較多的孢子體，而孢子體經(jīng)過(guò)培育就會(huì)分化出東北對(duì)開(kāi)蕨的小植株。原葉體分化孢子體可以直接通過(guò)試管外基質(zhì)培養(yǎng)，一方面提前適應(yīng)自然氣候，減少試管出瓶煉苗環(huán)節(jié)，另一方面也降低了試管內(nèi)的養(yǎng)護(hù)成本。由表2可見(jiàn)，在養(yǎng)護(hù)階段噴施誘導(dǎo)液均能促進(jìn)孢子體形成，不添加誘導(dǎo)液僅僅噴施清水，孢子誘導(dǎo)率僅為42，但三種誘導(dǎo)液誘導(dǎo)率差別也較大，綜合比較噴施0.1% KH2PO4 溶液效果最好，孢子體誘導(dǎo)率達(dá)到了56%。

3? 結(jié)論與討論

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集分離東北對(duì)開(kāi)蕨孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)，初步得出了孢子植株再生的途徑：孢子試管培養(yǎng)初步得出原葉體，原葉體通過(guò)擴(kuò)繁得到更多的數(shù)量，然后把這些原葉體進(jìn)行試管外誘導(dǎo)形成孢子體，培養(yǎng)孢子體就會(huì)得到東北對(duì)開(kāi)蕨的植株。在這個(gè)環(huán)節(jié)中關(guān)鍵是原葉體的試管增殖階段和孢子體的試管外誘導(dǎo)階段，經(jīng)過(guò)比較得出了試管內(nèi)采用MS培養(yǎng)基增殖效果最好，試管外培養(yǎng)過(guò)程中定期噴施0.1% KH2PO4誘導(dǎo)劑效果最好。在整個(gè)孢子離體培養(yǎng)過(guò)程中，前期階段該實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)僅僅為培養(yǎng)出原葉體以供增殖即可，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)僅僅局限在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而實(shí)際的生產(chǎn)中原葉體誘導(dǎo)也很關(guān)鍵，所以原葉體誘導(dǎo)有沒(méi)有更好的配方還有待進(jìn)一步研究。

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（編輯：李曉琳）