赤芝與無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)特性比較

柯斌榕吳小平*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002）

赤芝與無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)特性比較

柯斌榕1,2吳小平1,2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002）

以赤芝Ganoderma lucidum和無(wú)柄靈芝Ganoderma resinaceum擔(dān)孢子為材料，從擔(dān)孢子采集方法、萌發(fā)條件及保藏時(shí)間等方面，比較兩種擔(dān)孢子的萌發(fā)特性。結(jié)果表明，無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子在無(wú)菌水中培養(yǎng)24 h即可萌發(fā)產(chǎn)生芽管，48 h萌發(fā)率為6.77%；而赤芝只有早期彈射的新鮮擔(dān)孢子可以在麥芽汁培養(yǎng)基中萌發(fā)，但萌發(fā)率僅有1.13%。赤芝擔(dān)孢子根據(jù)形態(tài)大小可分為3類(lèi)，其中可萌發(fā)擔(dān)孢子的平均長(zhǎng)為7.38 μm，寬為4.46 μm，小于成熟擔(dān)孢子，細(xì)胞壁顏色也比成熟擔(dān)孢子淺。靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)時(shí)一般在擔(dān)孢子頂端或臍狀處產(chǎn)生一個(gè)芽管，極少數(shù)兩處同時(shí)產(chǎn)生芽管。新生菌絲在不適宜繼續(xù)生長(zhǎng)條件下，可進(jìn)一步形成厚垣孢子；且隨著擔(dān)孢子保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其萌發(fā)率快速降低。

赤芝；無(wú)柄靈芝；擔(dān)孢子；萌發(fā)率

靈芝又名赤芝、靈芝草，是我國(guó)最著名的藥用真菌，因其所具有的獨(dú)特功效為世人所稱(chēng)頌。早在2 000多年前，我國(guó)便有了靈芝的記載，從《山海經(jīng)》到《白蛇傳》，從《神農(nóng)本草經(jīng)》到《本草綱目》都有關(guān)于靈芝的傳說(shuō)和藥效的描述[1]。上世紀(jì)70年代，林志彬在對(duì)靈芝藥理和臨床研究過(guò)程中提出靈芝有“扶正固本”的作用機(jī)制，并在長(zhǎng)期的研究中證明并完善了這一理論[2]。隨著靈芝的功效不斷為人所知，市場(chǎng)逐步擴(kuò)大，與此同時(shí)人們對(duì)靈芝產(chǎn)品質(zhì)量要求也不斷提高。我國(guó)靈芝新品種主要靠野生采集馴化獲得，近年來(lái)物理誘變[3]，原生質(zhì)體融合[4]及原生質(zhì)體單核化[5]等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靈芝品種的改良，但因赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)比較困難，限制了其擔(dān)孢子遺傳多樣性的利用和開(kāi)發(fā)。

本研究比較了國(guó)內(nèi)廣泛栽培的赤芝和無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)特性，以期了解靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)規(guī)律，進(jìn)而獲得由擔(dān)孢子萌發(fā)的單核菌株的方法，為靈芝遺傳分析與新品種選育和改良打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

赤芝、無(wú)柄靈芝菌株來(lái)源于福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基：取波美度為4度的麥芽汁200 mL加水定容至1 L，121 ℃下滅菌30 min；馬鈴薯液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水l 000 mL，pH自然，121 ℃下滅菌30 min；袋料栽培培養(yǎng)基：75%雜木屑，20%麩皮，3%玉米粉，1%石膏粉，1%輕質(zhì)碳酸鈣，高壓滅菌2 h。

1.3 擔(dān)孢子采集與觀察

栽培包菌絲滿(mǎn)袋后，進(jìn)行岀芝管理，選取分化正常的子實(shí)體進(jìn)行信封套袋收集孢子。套袋前預(yù)先放置一張硫酸紙?jiān)谛欧庵?，并進(jìn)行滅菌處理。套袋時(shí)要注意子實(shí)體菌管層不能與硫酸紙接觸，留一定的空間以利于子實(shí)體彈射孢子。每天查看是否有孢子彈射，如有孢子彈射即可進(jìn)行萌發(fā)處理。以光學(xué)顯微鏡和電子掃描顯微鏡觀察擔(dān)孢子。

1.4 擔(dān)孢子萌發(fā)處理

圖1 赤芝和無(wú)柄靈芝的擔(dān)孢子形態(tài)

將獲得的靈芝孢子用裝有1 mL無(wú)菌水的離心管進(jìn)行稀釋?zhuān)袷幘鶆?，形成孢子懸浮液，吸取少許懸浮液于顯微鏡下觀察，控制孢子在10倍物鏡視野里面的數(shù)量在100～200個(gè)之間。最后各取100 μL分別裝入含有0.9 mL馬鈴薯液體的培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中，并用無(wú)菌水作為對(duì)照處理。封口后放在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次。當(dāng)靈芝孢子萌發(fā)出芽管時(shí)，即可認(rèn)為該孢子萌發(fā)，并計(jì)算萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子總數(shù)/孢子總數(shù)×100%。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 孢子大小測(cè)定

依據(jù)吳曉航的方法[6]加以改進(jìn)，用顯微拍照系統(tǒng)對(duì)孢子及鏡臺(tái)測(cè)微尺拍照，利用等比例測(cè)量原理測(cè)定孢子的大小。

2 結(jié)果分析

2.1 兩種靈芝擔(dān)孢子形態(tài)觀察

圖1為兩種擔(dān)孢子光學(xué)及掃描電子顯微鏡圖片，可以看出赤芝擔(dān)孢子呈卵圓形或頂端平截，具有雙層壁，外壁透明，平滑，內(nèi)壁淡褐色或近褐色，有小刺，有時(shí)中間有油滴狀物。掃描電鏡下可見(jiàn)擔(dān)孢子表面有凹陷或少量孔道，孢子基部有臍狀附屬物，成熟擔(dān)孢子大小為8.8～9.9×5.0～6.0（μm）。

無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子呈卵形，與赤芝孢子相類(lèi)似，但略大于赤芝孢子，頂部透明塞狀結(jié)構(gòu)較赤芝小。具有雙層細(xì)胞壁，外壁透明，平滑，近無(wú)色至淡褐色，中間可見(jiàn)有油滴。掃描電鏡下可見(jiàn)孢子表面有明顯的孔洞，孢子基部有臍狀附屬物，成熟擔(dān)孢子大小為8.5～10.0×6.5～7.0（μm）。

2.2 不同萌發(fā)處理對(duì)孢子萌發(fā)的影響

不同萌發(fā)處理試驗(yàn)，赤芝擔(dān)孢子只在麥芽汁培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)30 h后，才能觀察到有孢子萌發(fā)（圖2A），48 h后萌發(fā)率為1.13%；而無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子在無(wú)菌水中24 h就可萌發(fā)（圖2B），在無(wú)菌水、馬鈴薯液體培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中48 h的萌發(fā)率分別為6.78%、12.07%和23.39%。另還發(fā)現(xiàn)，赤芝擔(dān)孢子只有收集早期新鮮彈射的，才能觀察到萌發(fā)，子實(shí)體成熟期彈射的擔(dān)孢子未見(jiàn)萌發(fā)；而無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子，不論收集哪個(gè)階段的擔(dān)孢子都能夠萌發(fā)，且萌發(fā)率不相上下。

圖2 赤芝與無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)形態(tài)

圖3 無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)過(guò)程

2.3 靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)特性

赤芝和無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)過(guò)程基本相同，大多先在擔(dān)孢子頂端開(kāi)始出現(xiàn)芽管或膨大為球狀的芽管（圖3A），進(jìn)而形成單根或多根新生菌絲（圖3B，C）。也發(fā)現(xiàn)少數(shù)的芽管在底部臍狀處（圖3D），或在擔(dān)孢子頂部和臍狀處同時(shí)形成（圖3E）。萌發(fā)過(guò)程中擔(dān)孢子仍保存完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，逐漸變?yōu)橥该髦锌諣顟B(tài)。此外，無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子在水中萌發(fā)后，菌絲能夠利用孢子自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速生長(zhǎng)，并在后期營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)形成大量膨大厚壁的厚垣孢子（圖3F）。

2.4 赤芝擔(dān)孢子大小與萌發(fā)率關(guān)系

通過(guò)比較萌發(fā)孢子與未萌發(fā)孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)赤芝具有萌發(fā)能力的孢子顏色較淺且孢子較小，而無(wú)柄靈芝未萌發(fā)的孢子與萌發(fā)的孢子則沒(méi)有差別。采用顯微測(cè)量比較未萌發(fā)與萌發(fā)的赤芝擔(dān)孢子，可以將早期新鮮彈射的赤芝擔(dān)孢子分為三類(lèi)（圖4）：第Ⅰ類(lèi)為發(fā)育成熟的擔(dān)孢子，其平均長(zhǎng)為9.74μm，寬為5.56 μm，屬典型瓜子形（圖5B），該類(lèi)擔(dān)孢子不能萌發(fā)，占總數(shù)的80.43%；第Ⅱ類(lèi)為發(fā)育不良的擔(dān)孢子，其平均長(zhǎng)為7.85 μm，寬為3.78 μm，呈細(xì)長(zhǎng)形（圖5C），該類(lèi)擔(dān)孢子也不能萌發(fā)，占總數(shù)的13.87%；第Ⅲ類(lèi)擔(dān)孢子平均長(zhǎng)為7.38 μm，寬為4.46 μm，呈近橢圓形（圖5D），該類(lèi)擔(dān)孢子可萌發(fā)，占總數(shù)的5.70%。此外，隨著赤芝子實(shí)體不斷發(fā)育成熟，所彈射的孢子中Ⅰ類(lèi)孢子所占比重加大，Ⅲ類(lèi)孢子所占比例下降。

2.5 孢子保藏時(shí)間與萌發(fā)率的關(guān)系

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)率與保藏天數(shù)關(guān)系密切。赤芝擔(dān)孢子室溫避光放置一天就很難觀察到孢子萌發(fā)，而無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子室溫保藏4天仍有3.19%的萌發(fā)率（圖6）。因此赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用當(dāng)天收集的擔(dān)孢子。

圖4 赤芝三類(lèi)擔(dān)孢子大小及所占比例

圖5 不同大小的赤芝孢子形態(tài)

圖6 無(wú)柄靈芝擔(dān)孢子不同保藏時(shí)間的萌發(fā)率

3 討 論

靈芝擔(dān)孢子作為靈芝的有性孢子，不僅可以作為一種保健品，而且是靈芝品種改良和遺傳分析的重要材料。在光學(xué)顯微鏡下觀察無(wú)柄靈芝和赤芝的擔(dān)孢子，其形態(tài)相近，如果不加以細(xì)致區(qū)分有可能造成混淆。掃描電鏡可以看見(jiàn)無(wú)柄靈芝的細(xì)胞壁表面有較多的孔道，明顯區(qū)別于赤芝擔(dān)孢子。靈芝屬真菌其擔(dān)孢子都具有雙層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但不同靈芝種間的擔(dān)孢子形狀與構(gòu)造不盡相同。不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與表面孔道和紋飾，可以用于區(qū)分不同種的靈芝，同時(shí)結(jié)構(gòu)差異也可能影響孢子的萌發(fā)率。Leslie在進(jìn)行靈芝孢子結(jié)構(gòu)研究時(shí)指出，孢子的雙層厚壁結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙孢子的萌發(fā)[7]。

通過(guò)比較赤芝和無(wú)柄靈芝的擔(dān)孢子萌發(fā)特性，發(fā)現(xiàn)二者在擔(dān)孢子萌發(fā)率上差異很大，且萌發(fā)處理?xiàng)l件也有區(qū)別。赤芝的擔(dān)孢子不僅萌發(fā)率低，且對(duì)擔(dān)孢子收集的時(shí)間和處理的方法都有一定要求。在收集擔(dān)孢子的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，與常見(jiàn)傘菌子實(shí)體不同，靈芝只有生長(zhǎng)中的子實(shí)體才能彈射擔(dān)孢子，而采收下來(lái)的子實(shí)體則不能通過(guò)彈射收集到孢子。盡管在實(shí)驗(yàn)條件下很早就觀察到赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)，并測(cè)定萌發(fā)率在1%～2%之間[8～10]，但也有很多不成功的案例[11,12]。也有研究表明赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)率可達(dá)到8%～15%或70%[13,14]。由于近年來(lái)研究表明靈芝G. lucidum與我國(guó)廣泛栽培的赤芝并不是相同的種[15]，所以前人研究所用的品種是否與本研究相同很難確定。

不同種靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)率差異很大，如本研究中的無(wú)柄靈芝孢子的萌發(fā)達(dá)到23.39%；狹長(zhǎng)孢靈芝Ganoderma boninense擔(dān)孢子在多種培養(yǎng)基中都可以萌發(fā)，48 h最大萌發(fā)率可達(dá)97.5%[16]。因此靈芝間截然不同的擔(dān)孢子萌發(fā)率，可能暗示著它們?cè)趽?dān)孢子傳播上的不同策略。一類(lèi)是通過(guò)高萌發(fā)率來(lái)保證傳播的成功率；另一類(lèi)是通過(guò)采用在特定條件下萌發(fā)以克服不利條件，如赤芝成熟擔(dān)孢子較厚的細(xì)胞壁既有利于承受傳播過(guò)程中不利環(huán)境的影響，也能夠在通過(guò)昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)以后仍有較大的存活機(jī)率，進(jìn)而保證擔(dān)孢子的傳播。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)與其孢子大小和孢子顏色有關(guān)，很可能是因?yàn)槊劝l(fā)的孢子個(gè)體小、細(xì)胞壁發(fā)育還不完全，可以在適合條件下萌發(fā)。赤芝擔(dān)孢子的萌發(fā)率與孢子采集的新鮮程度以及萌發(fā)處理方式有密切關(guān)系，用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的孢子最好是靈芝子實(shí)體最早彈射的一批孢子。有人認(rèn)為做萌發(fā)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選用后期釋放的孢子，認(rèn)為后期擔(dān)孢子細(xì)胞壁幾丁質(zhì)程度較低有利于擔(dān)孢子萌發(fā)[13]。Nuss通過(guò)對(duì)靈芝孢子萌發(fā)規(guī)律的研究指出，前期孢子萌發(fā)迅速，而后期彈射的孢子必須先通過(guò)昆蟲(chóng)的腸道消化才能萌發(fā)[17]。這一點(diǎn)也在橡膠靈芝Ganoderma pseudoferreum擔(dān)孢子喂養(yǎng)大蚊幼蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)中得到證明[18]。借助于本研究能夠獲得赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)的單核菌株，可以用于遺傳分析和品種改良工作，而如何打破成熟赤芝擔(dān)孢子的休眠，提高其萌發(fā)率，則還需要作進(jìn)一步的研究。

[1] 林志彬. 靈芝的現(xiàn)代研究(第三版)[M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007: 1-12.

[2] 林志彬. 中西醫(yī)結(jié)合研究詮釋靈芝的扶正固本功效[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 20(6): 1-3.

[3] 李剛, 楊凡, 李瑞雪, 等. 原生質(zhì)體紫外誘變選育靈芝新菌種的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41(2): 229-233.

[4] 彭衛(wèi)紅, 鄭林用, 甘炳成, 等. 靈芝原生質(zhì)體融合HH系列菌株的選育研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 19(3): 498-501.

[5] 吳小平, 劉方, 謝玉榮, 等. 靈芝原生質(zhì)體單核化雜交育種[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25(23): 64-69.

[6] 吳小航, 吳軍. 同倍顯微相片測(cè)微尺法[J]. 遼寧師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 1991, 14(1): 69-73.

[7] Leslie CC. Structure of spore wall in Ganoderma[J]. Botanical Gazette, 1927, 83(1): 48-60.

[8] Bose SR. Artificial culture of Ganoderma lucidum Leyss from spore to spore[J]. Botanical Gazette, 1929, 87: 665-667.

[9] Subodh KS. Spore-germination of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr. ) Karst[J]. Current Science, 1943, 12(2): 59-60.

[10] Anjali S. Nuclear phenomena in the life cycle of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr. ) Karst[J]. Canadian Journal of Botany, 1959, 37: 59-64.

[11] Venkatarayan SV. The biology of Ganoderma lucidum on area cocoanut palms[J]. Phytopathology, 1936, 26: 153-175.

[12] 林俊華, 鄧優(yōu)錦, 謝寶貴. 靈芝原生質(zhì)體單核化雜交子的評(píng)價(jià)[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2010, 39(5): 534-537.

[13] 陸文樑, 常永禎. 靈芝子實(shí)體人工培養(yǎng)中某些生物學(xué)特性研究[J]. 植物學(xué)報(bào), 1975, 17(2): 153-159.

[14] 王德芝, 陳瓊. 幾種因素對(duì)靈芝孢子萌發(fā)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25(23): 102-104.

[15] 戴玉成, 曹云, 周麗偉, 等. 中國(guó)靈芝學(xué)名之管見(jiàn)[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2013, 32(6): 947-952.

[16] Ho YW, Nawawi A. Germination studies of Ganoderma boninense spores from oil palms in Malaysia[J]. Pertanika, 1986, 9(2): 151-154.

[17] Nuss I. Die bedeutung der proterosporen: schiussfolgerungen aus unter uchungen an Ganoderma (basidiomyeetes) [J]. Plant Systematics and Evolution, 1982, 141: 53-79.

[18] Lim TM. Production germination and dispersal of basidiospores of Ganoderma pseudoferreum on Hevea[J]. Journal of the Rubber Research Institute of Malaysia, 1977, 25(2): 93-99.

Characteristics comparison of basidiospore germination of Ganoderma lucidum and Ganoderma resinaceum

Ke Binrong1,2Wu Xiaoping1,2*
（1. School of Life Sciences of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China；2. Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002,China）

Based on the materials of the basidiospores of Ganoderma lucidum and Ganoderma resinaceum, the germination characteristics were compared in the aspects of the collecting methods, germination conditions, storage time and etc. The results showed that the basidiospores G. resinaceum germinated germ tubes in 24h in the sterile water, and after 48h the germination rate reached to 6.77%. And only the fresh catapulting basidiospores could germinate in wort medium though the germination rate of G. lucidum was just 1.13%. According to the size and morphology, the basidiospores of G. lucidum can be divided into three categories. The average length and width of germinable G. lucidum basidiospores were 7.38μm and 4.46μm， respectively， smaller than the mature basidiospores. And the color of the cell walls was aslo lighter than that of the mature basidiospores. The germination process was featured with a germ tube on the top of basidiospores or in the hilum, in rare cases one germ tube in each part. If the conditions were not fit for mycelium growth, chlamydospore would take shape. With the storage time goes on, the germination rate will fall rapidly.

Ganoderma lucidum; Ganoderma resinaceum; basidiospore; germination rate

S567.3+1

A

2095-0934（2015）05-282-06

福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目“靈芝種業(yè)創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化工程”（項(xiàng)目編號(hào)：2014S1477-21）

柯斌榕（1986—），男，福建農(nóng)林大學(xué)2010級(jí)碩士研究生，現(xiàn)分配福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所工作

吳小平（1965—），博士，教授，主要從事食藥用菌教學(xué)及科研工作。E-mail：fjwxp@126.com