慢性乙型肝炎肝組織中T-bet的表達(dá)及臨床病理意義

茍繼周，李曉星，孫 炎，彭 程，張鴻英，趙 霞，孫宜康，羅偉仁，喻 宏

人類(lèi)感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)會(huì)引起不同程度病變的肝臟疾病，有急性感染和慢性感染，而慢性感染有不同的臨床表現(xiàn)，從輕度肝炎到肝硬化，最終發(fā)展成肝癌和終末期肝功能衰竭[1]。有關(guān)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的發(fā)病機(jī)制研究表明，機(jī)體感染HBV后并不直接對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，而是HBV在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答損傷肝細(xì)胞所致[2]。感染HBV后引起的肝損傷免疫應(yīng)答的細(xì)胞通路非常復(fù)雜，在影響機(jī)體免疫應(yīng)答的眾多因素中，CD4+輔助性T細(xì)胞發(fā)揮的應(yīng)答對(duì)感染的預(yù)后有重要影響[2]。那么T-bet作為CD4+Th1型細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)錄因子，在CHB免疫應(yīng)答中發(fā)揮什么作用呢？已有研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)外周血中CD4+輔助性T細(xì)胞的T-bet mRNA表達(dá)[3]。外周血研究并不能準(zhǔn)確的反映肝組織內(nèi)的實(shí)際情況[4]。目前，T-bet在CHB肝組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)T-bet在CHB肝組織中的表達(dá)，并對(duì)其在CHB發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集深圳市第三人民醫(yī)院(南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院)2010年1月～2013年3月收治的62例CHB，其中男性47例，女性15例，年齡24～66歲，中位年齡(36.4±9.36)歲。所有患者HBsAg陽(yáng)性，HBeAg或抗-HBe陽(yáng)性，HBV DNA陽(yáng)性或陰性，均經(jīng)肝穿刺活檢。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年)[5-6]，并對(duì)病理炎癥分級(jí)進(jìn)行分組，其中G1組23例，G2組19例，G3組12例，G4組8例；按纖維增生程度分組，其中S1組15例，S2組16例，S3組17例，S4組14例。所有患者均排除其他肝炎病毒重疊感染或酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和藥物性肝炎等其他肝病。

1.2 主要試劑兔抗人T-bet(1∶100稀釋)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗人CD4單克隆抗體(即用型)和ChemMate EnVision檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Dako公司。

1.3 方法肝組織在彩超引導(dǎo)下通過(guò)彈射式組織活檢槍方法取得，長(zhǎng)約1.5 cm，取材后立即經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、浸蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。依次行HE染色、天狼猩紅染色。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立在光鏡下對(duì)肝組織病理變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)其炎癥和纖維化進(jìn)行分級(jí)分期。3 μm厚肝組織切片常規(guī)脫蠟至水，采用高壓熱修復(fù)抗原。滴加3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min(CD4使用0.3%過(guò)氧化氫)，滴加一抗4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗后滴加二抗37 ℃孵育45 min。PBS沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。以上操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以PBS替代一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。所有切片采用同一批試劑完成。

1.4 結(jié)果判斷T-bet表達(dá)定位于細(xì)胞核，CD4表達(dá)定位于細(xì)胞膜，均呈棕黃色為陽(yáng)性。T-bet、CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)：在高倍鏡下對(duì)整條肝組織進(jìn)行觀察，然后對(duì)匯管區(qū)內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CHB肝組織中T-bet的表達(dá)在CHB肝組織中，T-bet呈散在或聚集分布(圖1)；絕大部分T-bet分布在匯管區(qū)、界板、橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)；小葉中有少量表達(dá)，但大多散在分布，也有一些灶性表達(dá)(圖2)。

2.2 CHB不同分級(jí)分期中T-bet的表達(dá)G1級(jí)CHB肝組織中，匯管區(qū)有少量的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞(圖3)；G2級(jí)CHB肝組織中，匯管區(qū)有中等量的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞(圖4)，界面炎的肝細(xì)胞間也有少量T-bet陽(yáng)性細(xì)胞；G3級(jí)CHB肝組織中，除匯管區(qū)有多量的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞外，橋接壞死區(qū)也有較多的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞(圖5)；G4級(jí)CHB肝組織中，匯管區(qū)和融合壞死區(qū)可見(jiàn)大量的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞(圖6)。隨著CHB炎癥逐漸加重，T-bet在肝組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)逐漸增多(r=0.869，P<0.01，表1)；同時(shí)，T-bet在CHB肝組織的表達(dá)隨著纖維化程度加重而增多(r=0.423，P<0.01，表1)。

表1 CHB不同分級(jí)、分期中T-bet表達(dá)水平的比較

2.3 T-bet與CD4表達(dá)的相關(guān)性隨著CHB病理分級(jí)分期的加重，CD4表達(dá)增多(表2)。T-bet在CHB肝組織的表達(dá)亦隨著CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增多而增多，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.938，P<0.01)。

表2 CHB不同分級(jí)分期中CD4表達(dá)水平的比較

3 討論

T-bet最初從Th1 cDNA文庫(kù)中分離得到，能與Th1特異的探針雜交，在向Th1細(xì)胞發(fā)育分化的早期T細(xì)胞中誘導(dǎo)T-bet表達(dá)。T-bet和GATA-3是Th1型細(xì)胞和Th2型細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子。目前，T-bet與CHB的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系尚不完全清楚，且大多是通過(guò)外周血標(biāo)本來(lái)觀察研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肝組織穿刺標(biāo)本觀察T-bet在肝臟中的表達(dá)，分析T-bet與CHB病變中炎癥和纖維化的關(guān)系。該方法的特點(diǎn)是在組織原位直接觀察T-bet在CHB病變組織中的分布，通過(guò)形態(tài)學(xué)可視化的方法闡述T-bet與CHB病變的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)：在CHB肝組織中，T-bet呈散在或聚集分布，且絕大部分T-bet分布在匯管區(qū)、界板、橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)；小葉中有少量表達(dá)，大多散在分布，也有一些灶性的表達(dá)方式。當(dāng)機(jī)體感染HBV后與T-bet相關(guān)的免疫應(yīng)答先在匯管區(qū)開(kāi)始，而后隨著病變的加重，逐步從界板炎到橋接壞死和融合壞死發(fā)展。這可能是由于CHB炎癥活動(dòng)初期，大量的HBV特異性T細(xì)胞首先浸潤(rùn)于匯管區(qū)，然后隨著疾病的發(fā)展逐漸破壞界板，形成橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)。

①②③④⑤⑥

本研究發(fā)現(xiàn)，T-bet在CHB肝組織中的表達(dá)隨著CD4細(xì)胞數(shù)量的增多而增多，兩者呈顯著正相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在急性HBV感染中T-bet在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平增加，而長(zhǎng)期慢性感染期間T-bet在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)喪失[7]。也就是說(shuō)，CHB肝組織中表達(dá)T-bet的細(xì)胞可能以Th1型CD4+T淋巴細(xì)胞居多，因此T-bet表達(dá)隨著CD4+細(xì)胞的增多而增多。當(dāng)然，不可否認(rèn)T-bet在眾多免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)[8]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著CHB炎癥逐漸加重，T-bet在肝匯管區(qū)內(nèi)的表達(dá)逐漸增多，而且隨著病變程度加重，T-bet陽(yáng)性細(xì)胞分布范圍擴(kuò)大。可能的機(jī)制:當(dāng)機(jī)體感染HBV后，病毒作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子IL-12，IL-12誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生，并促進(jìn)Th0型細(xì)胞增殖分化成Th1型細(xì)胞，IFN-γ通過(guò)STAT1誘導(dǎo)T-bet表達(dá)，T-bet反過(guò)來(lái)又可誘導(dǎo)IFN-γ和IL-12Rβ2表達(dá)，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán),協(xié)同促進(jìn)Th1型細(xì)胞增殖[9-10]。

此外，T-bet激活除了與CD11a的表達(dá)增加有關(guān)外，還與促P-選擇素和P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL1)糖基化結(jié)合酶的表達(dá)相關(guān)，該特性是T細(xì)胞黏附發(fā)炎內(nèi)皮細(xì)胞和遷移到炎癥部位的必要條件。同時(shí)，T-bet直接激活Th1型細(xì)胞特異性基因，包括一些細(xì)胞因子和趨化因子，遷移并招募其他免疫細(xì)胞到炎癥部位，從而控制局部組織的感染[11]。本實(shí)驗(yàn)顯示CHB中絕大部分T-bet陽(yáng)性細(xì)胞分布在匯管區(qū)及壞死區(qū)的炎性病變區(qū)，說(shuō)明T-bet陽(yáng)性T細(xì)胞最先通過(guò)血液循環(huán)被運(yùn)輸?shù)皆搮^(qū)域，并發(fā)揮相應(yīng)的免疫應(yīng)答。

CHB的炎癥分級(jí)和纖維化分期常同步發(fā)展，但也有不一致的情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-bet在CHB肝組織的表達(dá)隨著纖維化程度加重而增多，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)納入病例的炎癥分級(jí)和纖維化分期同步發(fā)展而造成。

總之，本組通過(guò)免疫組化法檢測(cè)T-bet表達(dá)與CHB炎癥活動(dòng)度、纖維化程度以及CD4細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，提示其在CHB病變的發(fā)展以及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。