腦膜瘤組織中HIF-1α、EphA2蛋白的表達(dá)及意義

左延卿，崔 明，王 煒，邢益祥，趙 鐵，代興亮

腦膜瘤起源于蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，發(fā)病率高，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤30%以上。WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類將腦膜瘤分為3級：Ⅰ級為良性腫瘤，但術(shù)后臨床上仍有較多復(fù)發(fā)；Ⅱ級為非典型腦膜瘤；Ⅲ級為惡性，具有強(qiáng)侵襲性和高復(fù)發(fā)率[1]。腫瘤生長需要營養(yǎng)供應(yīng)，腦膜瘤快速增長需要其微環(huán)境增加供氧量[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induc ible factor-1α, HIF-1α)及下游的血管生成有關(guān)標(biāo)志性蛋白上皮細(xì)胞激酶A2(epithelial cell kinase A2, EphA2)參與腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞中EphA2高表達(dá)[4]；EphA2在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃組織，抑制EphA2蛋白表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的生長[5]。但HIF-1α、EphA2表達(dá)與腦膜瘤臨床病理分級和復(fù)發(fā)的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文著重探討腦膜瘤中HIF-1α、EphA2蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，為腦膜瘤臨床診療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月～2017年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽省銅陵市人民醫(yī)院存檔的68例腦膜瘤組織標(biāo)本，均為初診并行手術(shù)治療，68例腦膜瘤患者均為0級Simpson切除，手術(shù)完整切除腫塊和累及的硬腦膜組織，再切除周圍擴(kuò)大約2 cm的硬腦膜，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)均證實(shí)為腦膜瘤。其中男性27例(占39.7%)，女性41例(占60.3%)；年齡40～78歲，平均(52.4±13.6)歲；術(shù)前患者均未行放、化療。所有患者均對該項(xiàng)研究知情同意，按照WHO腦膜瘤分級，其中Ⅰ級37例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用SP法，手術(shù)切除腫瘤組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，60 ℃烘箱烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鈉微波抗原修復(fù)，羊血清封閉，按照試劑盒說明書操作，滴加一抗(兔抗人多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，滴加酶標(biāo)羊抗兔抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，鏡下觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照。兔抗人HIF-1α、EphA2單克隆抗體購于Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒、SP試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2.2Western blot法 取液氮凍存的手術(shù)切除的不同級別腦膜瘤組織，添加RIPA組織蛋白裂解液，研磨、超聲破碎，蛋白濃度測定采取BCA法。取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，分別加入兔抗人HIF-1α和EphA2多克隆抗體(PBS稀釋1∶1 500)，次日孵育二抗，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影，Image J軟件分析灰度，以GAPDH為內(nèi)參(PBS稀釋1∶2 000)，HIF-1α和EphA2蛋白灰度值和內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 結(jié)果判斷HIF-1α、EphA2結(jié)果判定由3名資深病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，陽性細(xì)胞判定為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色均勻，呈棕黃色或棕褐色；免疫組化染色陽性計(jì)分參考文獻(xiàn)[6]，根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；得分0～1分為低表達(dá)，2～3分為高表達(dá)。

1.4 隨訪68例腦膜瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況采取門診和電話咨詢，隨訪時(shí)間從手術(shù)日開始，截至2018年12月，其中4例患者失訪，隨訪時(shí)間12～60個(gè)月，中位時(shí)間36個(gè)月，隨訪中發(fā)現(xiàn)腦膜瘤復(fù)發(fā)者9例，其中Ⅰ級1例，Ⅱ級4例，Ⅲ級4例。

2 結(jié)果

2.1 腦膜瘤組織中HIF-1α、EphA2蛋白的表達(dá)68例腦膜瘤中，HIF-1α蛋白高表達(dá)32例(47.1%)，低表達(dá)36例(52.9%)，陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖1、2)；EphA2蛋白高表達(dá)35例(51.5%)，低表達(dá)33例(48.5%)，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈黃色和棕黃色為陽性(圖3、4)。

2.2 不同分級腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達(dá)WHO將腦膜瘤分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級，本組采用免疫組化染色觀察到隨著腦膜瘤級別的升高，HIF-1α和EphA2的表達(dá)呈升高趨勢，不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.019，30.442，P<0.001，表1)。

表1 不同級別腦膜瘤組織中HIF-1α與EphA2蛋白的表達(dá)

2.3 Western blot法檢測腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達(dá)Western blot法檢測不同級別腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與Ⅰ級腦膜瘤組織相比，Ⅱ級和Ⅲ級分化的腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，P=0.005；P=0.026，P=0.004，圖5)。

①②③④

圖5 Western blot法檢測HIF-1α和EphA2的蛋白表達(dá)：A.Western blot檢測結(jié)果；B.蛋白表達(dá)的半定量統(tǒng)計(jì)；*P<0.05，**P<0.01

2.4 腦膜瘤中HIF-1α與EphA2表達(dá)與患者復(fù)發(fā)的關(guān)系68例腦膜瘤患者隨訪12～60個(gè)月，中位時(shí)間為36個(gè)月，4例失訪，有9例患者復(fù)發(fā)：復(fù)發(fā)者Ⅰ級1例(1/37，2.7%)，Ⅱ級4例(4/18，22.2%)，Ⅲ級4例(4/13，30.8%)。9例復(fù)發(fā)病例的HIF-1α蛋白表達(dá)免疫組化評分為2.82±1.08，59例非復(fù)發(fā)病例免疫組化評分為1.51±1.14，復(fù)發(fā)組較非復(fù)發(fā)組的評分顯著增高(P<0.01)。9例復(fù)發(fā)病例的EphA2蛋白表達(dá)免疫組化評分為2.91±1.15，非復(fù)發(fā)組免疫組化評分為(1.53±1.18)，復(fù)發(fā)組較非復(fù)發(fā)組的評分顯著增高(P<0.01)。

3 討論

腦膜瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，手術(shù)是目前治療腦膜瘤主要手段。WHO(2016)將腦膜瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，Ⅰ級雖然多為良性腫瘤，但也會(huì)復(fù)發(fā)和致死[3]。腫瘤切除范圍、腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移、惡性程度、腫瘤部位等原因是腦膜瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因，復(fù)發(fā)腦膜瘤治療目前尚缺乏統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。本組68例腦膜瘤患者，即使采用0級Simpson切除，仍有9例(13.2%)復(fù)發(fā)，與國內(nèi)外報(bào)道結(jié)果較一致[1,7]，目前腦膜瘤復(fù)發(fā)的分子機(jī)制尚不清楚。

腫瘤在發(fā)展進(jìn)程中，由于其快速增長，必然會(huì)出現(xiàn)缺血、缺氧，為增加其微環(huán)境中供氧，除血管內(nèi)皮管網(wǎng)外，常形成自身的管道結(jié)構(gòu)[2]。朱園園等[8]研究表明，HIF-1α在子宮內(nèi)膜腺癌中的陽性率明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜和不典型增生患者，且與子宮內(nèi)膜腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等相關(guān)，檢測HIF-1α蛋白表達(dá)可能為子宮內(nèi)膜腺癌的診療和預(yù)后提供依據(jù)。朱振華等[9]在胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，EphA2在胃癌組織中的陽性率顯著升高，且其表達(dá)與胃癌TNM分期、浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣提示，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、EphA2在腦膜瘤組織中表達(dá)升高，且與腦膜瘤分級有關(guān)。HIF-1α參與機(jī)體多種生理、病理過程，是哺乳動(dòng)物機(jī)體在缺氧狀態(tài)下，具有特異性的活化轉(zhuǎn)錄因子，與多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，尤其是介導(dǎo)缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和凋亡等過程[10]?？缒だ野彼峒っ甘荏wEphA2是一種酪氨酸激酶受體超家族成員，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞行為，實(shí)體腫瘤的快速生長易致瘤體內(nèi)部出現(xiàn)缺氧缺血微環(huán)境，缺氧相關(guān)因子表達(dá)失衡，在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)常出現(xiàn)HIF-1α表達(dá)上調(diào)[11]。HIF-1α核定位后，與缺氧應(yīng)答元素，如血管內(nèi)皮生長因子和EphA2等目標(biāo)基因結(jié)合，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本組結(jié)果證實(shí)隨著腦膜瘤組織臨床級別的升高和腫瘤復(fù)發(fā)，HIF-1α、EphA2表達(dá)呈上升趨勢，提示HIF-1α、EphA2參與腦膜瘤的病變。

綜上所述，HIF-1α、EphA2可能促進(jìn)腦膜瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測HIF-1α和EphA2可能作為腦膜瘤預(yù)后的指標(biāo)。