馬東林,樸穎實,毛美玲,曹丁方,劉紅剛
橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)是一種自身免疫性疾病,臨床表現(xiàn)為甲狀腺功能紊亂,病理可見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤,并可形成淋巴濾泡。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺常見的惡性上皮腫瘤,有文獻(xiàn)指出與PTC合并其他甲狀腺良性腫瘤的共檢率相比,PTC合并HT的共檢率更高(10%~58%)[1],但相關(guān)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。BRAF V600E突變是PTC的常見驅(qū)動突變[2],突變率為45%~80%,但在HT中較少發(fā)生。PTC合并HT時是否會影響B(tài)RAF的突變率,以及是否會對臨床病理特征產(chǎn)生影響目前尚不明確。BRAF V600E突變蛋白為BRAF V600E基因突變后表達(dá)的蛋白,目前鮮有人通過分析BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)情況來研究其對PTC合并HT臨床病理特征的影響。本實驗旨在通過檢測PTC合并HT中BRAF V600E蛋白的表達(dá)情況,結(jié)合臨床病理特征,分析BRAF V600E蛋白表達(dá)與HT和PTC之間可能存在的臨床病理關(guān)系,以期對其致病機(jī)制、疾病預(yù)后等方面的研究提供一定的理論依據(jù)。
1.1 材料收集2017年1月~2019年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院行甲狀腺半葉/全切除手術(shù)伴中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃且有完整臨床病理資料的465例經(jīng)典型PTC,其中139例為PTC合并HT,326例為無HT合并的單純PTC。
1.2 主要試劑BRFA V600E蛋白抗體(RM8,貨號ZA-0668,北京中杉金橋公司);通用型兩步法檢測試劑盒(PV 9000,北京中杉金橋公司)。
1.3 方法手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后,制成4 μm厚切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,蒸餾水沖洗后,PBS沖洗3遍,EDTA(pH 8.0)高壓蒸汽修復(fù)2.5 min,自然冷卻至室溫,PBS沖洗3遍后,采用免疫組化EnVision兩步法檢測。BRFA V600E蛋白抗體孵育溫度及時間為37 ℃ 40 min。用已知陽性組織切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。
1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)BRAF V600E抗體陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì),結(jié)果判定同時參考染色強(qiáng)度(0~3+)和陽性百分比(0~100%)兩個指標(biāo),腫瘤細(xì)胞陽性百分比≥20%且染色強(qiáng)度為2+以上時,定義為陽性。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,均數(shù)之間比較采用t檢驗,率的比較采用χ2檢驗,Logistic回歸分析用于分析是否合并HT時PTC臨床病理特征的相關(guān)危險因素,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 PTC中HT與臨床病理特征的關(guān)系入組465例PTC中,PTC合并HT組139例,無HT合并的單純PTC組326例。PTC患者平均發(fā)病年齡42.86歲,<55歲組占比81.08%,女性占比73.98%,腫瘤直徑≤1 cm占比59.78%,腫瘤多發(fā)占比34.84%,中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移占比54.41%。HT在PTC中的共檢率為29.89%,與單純PTC組相比,PTC合并HT組女性發(fā)病率更高(88.49%vs67.79%,P<0.001);PTC中HT與發(fā)病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05,表1)。
2.2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達(dá)BRAF V600E蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1),465例PTC中BRAF V600E蛋白的陽性率為66.88%,PTC合并HT組的BRAF V600E蛋白陽性率較單純PTC組低(59.71%vs69.94%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032,表2)。
表1 PTC中HT與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]
2.3 多元Logistic回歸分析HT與PTC的相關(guān)危險因素多元Logistic回歸分析PTC中HT與發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRAF V600E蛋白表達(dá)的相關(guān)危險因素,結(jié)果顯示HT與女性成正相關(guān)(OR=3.897,95%CI:2.182~6.960),與BRAF V600E蛋白陽性呈負(fù)相關(guān)(OR=0.605,95%CI:0.393~0.930),與發(fā)病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表3)。
HE染色BRAFV600E陽性HE染色BRAFV600E陰性PTC合并HT單純PTC
表2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達(dá)情況[n(%)]
表3 多元Logistic回歸分析橋本甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)危險因素
2.4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關(guān)系將PTC病例按是否存在HT和BRAF V600E突變蛋白分為四組,分別標(biāo)記為HT+BRAF V600E+、HT+BRAF V600E-、HT-BRAF V600E+、HT-BRAF V600E-,分別對不同組的臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。HT+BRAF V600E-組發(fā)病年齡較小(38.88歲),在<55歲患者占比也較高(92.86%),與其他組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05);四組相比,無論BRAF V600E蛋白是否表達(dá),合并HT的女性患病率均明顯高于男性;HT或BRAF V600E蛋白表達(dá)均與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表4)。
HT和PTC共存的流行病學(xué)和病因?qū)W研究一直是學(xué)者們研究的熱點,但目前尚未得出一致的結(jié)論[3]。Molnár等[4]認(rèn)為HT是促進(jìn)甲狀腺腫瘤發(fā)生的一種癌前狀態(tài)。發(fā)生HT時,慢性炎癥導(dǎo)致的免疫反應(yīng)通過與周圍基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)作用,可改變腫瘤微環(huán)境,最終造成基因改變、細(xì)胞增殖異常,向PTC轉(zhuǎn)化[5]。HT患者血清中促甲狀腺激素水平升高,刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞分化,也可能促進(jìn)PTC的發(fā)生[6]。為進(jìn)一步研究HT和PTC之間的臨床病理關(guān)系,本實驗收集465例PTC,根據(jù)是否合并HT分為兩組,以評估HT對PTC臨床病理特征的影響。本實驗中HT在PTC中的發(fā)生率為29.89%,與文獻(xiàn)報道10%~58%的共檢率相符[1]。有實驗表明HT對PTC進(jìn)展起保護(hù)性作用,合并HT的PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少見[7],但本實驗結(jié)果卻顯示HT與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),僅與患者性別及BRAF V600E蛋白表達(dá)相關(guān),與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)也無關(guān)。該結(jié)果與Kim等[1,8]的研究結(jié)果相同。實驗結(jié)果不同可能與實驗對象人群所處的地理環(huán)境不同以及HT的判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致等因素有關(guān)。Lee等[9]的研究中判斷HT時除病理學(xué)指標(biāo)外同時加入了血清學(xué)指標(biāo)甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb),當(dāng)TPOAb陽性時,PTC中出現(xiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤才預(yù)示腫瘤侵襲性較弱。本實驗并未檢測血清中TPOAb水平,僅通過鏡檢見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤、淋巴濾泡形成作為HT的病理學(xué)診斷依據(jù)。
表4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]
BRAF V600E突變是PTC的常見驅(qū)動突變,發(fā)生率為45%~80%。BRAF突變抗體在PTC中的應(yīng)用較廣泛,免疫組化檢測突變特異性BRAF V600E蛋白與Real-time PCR、測序法等檢測核酸突變有較高的一致性。本實驗使用克隆號為RM8的BRAF V600E抗體,該抗體可與BRAF V600E突變體反應(yīng),與野生型BRAF無交叉反應(yīng)。該抗體與熒光定量PCR檢測BRAF基因突變相比,敏感性為92%,特異性為92.6%,有較高的一致性。與克隆號為VE1的BRAF V600E抗體所報道的敏感性和特異性相似(89%~100%,61.5%~100%)[10-11]。目前,研究BRAF V600E突變蛋白表達(dá)在單純PTC及PTC合并HT中的臨床意義較少,核酸水平與蛋白水平的改變對臨床病理特征的影響是否一致,需進(jìn)一步探討。有研究指出BRAF V600E突變可以作為PTC復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子,并與結(jié)外轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高等預(yù)后不良因素有關(guān)[12]。HT中很少有報道檢測出BRAF突變,Sadow等[13]在28例HT中均未檢測出BRAF突變,Tennakoon等[14]也認(rèn)為HT中BRAF突變較低,可通過檢測BRAF基因突變情況對HT或PTC進(jìn)行區(qū)分。大部分研究指出PTC合并HT中可檢測出BRAF突變,但突變率較單純PTC低,本實驗中PTC合并HT的BRAF V600E蛋白陽性率低于單純PTC組(59.71%vs69.94%,P=0.032),與分子水平檢測結(jié)論一致。但在PTC合并HT中,BRAF突變對預(yù)后的影響仍存在爭議。發(fā)病年齡為甲狀腺腫瘤TNM分期的關(guān)鍵因素,<55歲患者即使出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也被分為Ⅱ期,預(yù)后較好。本實驗中PTC合并HT組中BRAF V600E蛋白陰性組的發(fā)病年齡比BRAF V600E蛋白陽性組的發(fā)病年齡小(38.88歲vs43.54歲,P=0.019)且<55歲患者年齡占比高(92.86%vs75.90%,P=0.009),可能提示BRAF V600E蛋白陰性組的預(yù)后好于陽性組。目前PTC合并HT的相關(guān)文獻(xiàn)中研究BRAF V600E突變對臨床病理特征的影響多是在分子水平檢測核酸的變化來判定BRAF基因突變。如Dong等[15]的一項研究指出PTC合并HT中如出現(xiàn)BRAF V600E突變則提示為腫瘤多發(fā)的指標(biāo)之一;Zeng等[16-17]均認(rèn)為PTC合并HT中即使發(fā)生了BRAF V600E突變,與單純PTC相比其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,為PTC的保護(hù)性因素。本實驗在蛋白水平檢測BRAF V600E突變蛋白的表達(dá),并未發(fā)現(xiàn)BRAF V600E蛋白表達(dá)與腫瘤多發(fā)和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。是否由于PTC合并HT中BRAF V600E突變率較低而使HT成為PTC的保護(hù)性因素,仍需進(jìn)一步探討。PTC合并HT中還存在RET/PTC原癌基因重排、PI3K/Akt通路激活等,HT和BRAF與這些通路之間有無共同影響也需進(jìn)行進(jìn)一步的探討。
總之,本實驗首次通過直接分析BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)情況,探討其對PTC合并HT臨床病理特征的影響,結(jié)果表明與單純PTC患者相比,PTC合并HT患者BRAF V600E蛋白的陽性率低;HT或BRAF V600E蛋白表達(dá)均與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步在分子水平研究PTC合并HT中BRAF V600E蛋白同其他分子通路的關(guān)系,以期闡明PTC與HT共存的分子機(jī)制,為指導(dǎo)診治提供理論支持。