甲狀腺乳頭狀癌合并橋本甲狀腺炎中BRAF V600E蛋白的表達(dá)及臨床意義

馬東林，樸穎實(shí)，毛美玲，曹丁方，劉紅剛

橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)是一種自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為甲狀腺功能紊亂，病理可見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，并可形成淋巴濾泡。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺常見的惡性上皮腫瘤，有文獻(xiàn)指出與PTC合并其他甲狀腺良性腫瘤的共檢率相比，PTC合并HT的共檢率更高(10%～58%)[1]，但相關(guān)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。BRAF V600E突變是PTC的常見驅(qū)動(dòng)突變[2]，突變率為45%～80%，但在HT中較少發(fā)生。PTC合并HT時(shí)是否會(huì)影響B(tài)RAF的突變率，以及是否會(huì)對(duì)臨床病理特征產(chǎn)生影響目前尚不明確。BRAF V600E突變蛋白為BRAF V600E基因突變后表達(dá)的蛋白，目前鮮有人通過分析BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)情況來研究其對(duì)PTC合并HT臨床病理特征的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測(cè)PTC合并HT中BRAF V600E蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合臨床病理特征，分析BRAF V600E蛋白表達(dá)與HT和PTC之間可能存在的臨床病理關(guān)系，以期對(duì)其致病機(jī)制、疾病預(yù)后等方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2019年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院行甲狀腺半葉/全切除手術(shù)伴中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃且有完整臨床病理資料的465例經(jīng)典型PTC，其中139例為PTC合并HT，326例為無HT合并的單純PTC。

1.2 主要試劑BRFA V600E蛋白抗體(RM8，貨號(hào)ZA-0668，北京中杉金橋公司)；通用型兩步法檢測(cè)試劑盒(PV 9000，北京中杉金橋公司)。

1.3 方法手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗后，PBS沖洗3遍，EDTA(pH 8.0)高壓蒸汽修復(fù)2.5 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3遍后，采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)。BRFA V600E蛋白抗體孵育溫度及時(shí)間為37 ℃ 40 min。用已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)BRAF V600E抗體陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)果判定同時(shí)參考染色強(qiáng)度(0～3+)和陽性百分比(0～100%)兩個(gè)指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞陽性百分比≥20%且染色強(qiáng)度為2+以上時(shí)，定義為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸分析用于分析是否合并HT時(shí)PTC臨床病理特征的相關(guān)危險(xiǎn)因素，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC中HT與臨床病理特征的關(guān)系入組465例PTC中，PTC合并HT組139例，無HT合并的單純PTC組326例。PTC患者平均發(fā)病年齡42.86歲，<55歲組占比81.08%，女性占比73.98%，腫瘤直徑≤1 cm占比59.78%，腫瘤多發(fā)占比34.84%，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移占比54.41%。HT在PTC中的共檢率為29.89%，與單純PTC組相比，PTC合并HT組女性發(fā)病率更高(88.49%vs67.79%，P<0.001)；PTC中HT與發(fā)病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05，表1)。

2.2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達(dá)BRAF V600E蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)，465例PTC中BRAF V600E蛋白的陽性率為66.88%，PTC合并HT組的BRAF V600E蛋白陽性率較單純PTC組低(59.71%vs69.94%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，表2)。

表1 PTC中HT與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 多元Logistic回歸分析HT與PTC的相關(guān)危險(xiǎn)因素多元Logistic回歸分析PTC中HT與發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRAF V600E蛋白表達(dá)的相關(guān)危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示HT與女性成正相關(guān)(OR=3.897，95%CI：2.182～6.960)，與BRAF V600E蛋白陽性呈負(fù)相關(guān)(OR=0.605，95%CI：0.393～0.930)，與發(fā)病年齡、腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表3)。

HE染色BRAFV600E陽性HE染色BRAFV600E陰性PTC合并HT單純PTC

表2 PTC中BRAF V600E蛋白的表達(dá)情況[n(%)]

表3 多元Logistic回歸分析橋本甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)危險(xiǎn)因素

2.4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關(guān)系將PTC病例按是否存在HT和BRAF V600E突變蛋白分為四組，分別標(biāo)記為HT+BRAF V600E+、HT+BRAF V600E-、HT-BRAF V600E+、HT-BRAF V600E-，分別對(duì)不同組的臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HT+BRAF V600E-組發(fā)病年齡較小(38.88歲)，在<55歲患者占比也較高(92.86%)，與其他組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；四組相比，無論BRAF V600E蛋白是否表達(dá)，合并HT的女性患病率均明顯高于男性；HT或BRAF V600E蛋白表達(dá)均與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(表4)。

3 討論

HT和PTC共存的流行病學(xué)和病因?qū)W研究一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，但目前尚未得出一致的結(jié)論[3]。Molnár等[4]認(rèn)為HT是促進(jìn)甲狀腺腫瘤發(fā)生的一種癌前狀態(tài)。發(fā)生HT時(shí)，慢性炎癥導(dǎo)致的免疫反應(yīng)通過與周圍基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)作用，可改變腫瘤微環(huán)境，最終造成基因改變、細(xì)胞增殖異常，向PTC轉(zhuǎn)化[5]。HT患者血清中促甲狀腺激素水平升高，刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞分化，也可能促進(jìn)PTC的發(fā)生[6]。為進(jìn)一步研究HT和PTC之間的臨床病理關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)收集465例PTC，根據(jù)是否合并HT分為兩組，以評(píng)估HT對(duì)PTC臨床病理特征的影響。本實(shí)驗(yàn)中HT在PTC中的發(fā)生率為29.89%，與文獻(xiàn)報(bào)道10%～58%的共檢率相符[1]。有實(shí)驗(yàn)表明HT對(duì)PTC進(jìn)展起保護(hù)性作用，合并HT的PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少見[7]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示HT與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，僅與患者性別及BRAF V600E蛋白表達(dá)相關(guān)，與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)也無關(guān)。該結(jié)果與Kim等[1,8]的研究結(jié)果相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象人群所處的地理環(huán)境不同以及HT的判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致等因素有關(guān)。Lee等[9]的研究中判斷HT時(shí)除病理學(xué)指標(biāo)外同時(shí)加入了血清學(xué)指標(biāo)甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)，當(dāng)TPOAb陽性時(shí)，PTC中出現(xiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤才預(yù)示腫瘤侵襲性較弱。本實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)血清中TPOAb水平，僅通過鏡檢見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤、淋巴濾泡形成作為HT的病理學(xué)診斷依據(jù)。

表4 PTC中HT和BRAF V600E蛋白與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

BRAF V600E突變是PTC的常見驅(qū)動(dòng)突變，發(fā)生率為45%～80%。BRAF突變抗體在PTC中的應(yīng)用較廣泛，免疫組化檢測(cè)突變特異性BRAF V600E蛋白與Real-time PCR、測(cè)序法等檢測(cè)核酸突變有較高的一致性。本實(shí)驗(yàn)使用克隆號(hào)為RM8的BRAF V600E抗體，該抗體可與BRAF V600E突變體反應(yīng)，與野生型BRAF無交叉反應(yīng)。該抗體與熒光定量PCR檢測(cè)BRAF基因突變相比，敏感性為92%，特異性為92.6%，有較高的一致性。與克隆號(hào)為VE1的BRAF V600E抗體所報(bào)道的敏感性和特異性相似(89%～100%，61.5%～100%)[10-11]。目前，研究BRAF V600E突變蛋白表達(dá)在單純PTC及PTC合并HT中的臨床意義較少，核酸水平與蛋白水平的改變對(duì)臨床病理特征的影響是否一致，需進(jìn)一步探討。有研究指出BRAF V600E突變可以作為PTC復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，并與結(jié)外轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高等預(yù)后不良因素有關(guān)[12]。HT中很少有報(bào)道檢測(cè)出BRAF突變，Sadow等[13]在28例HT中均未檢測(cè)出BRAF突變，Tennakoon等[14]也認(rèn)為HT中BRAF突變較低，可通過檢測(cè)BRAF基因突變情況對(duì)HT或PTC進(jìn)行區(qū)分。大部分研究指出PTC合并HT中可檢測(cè)出BRAF突變，但突變率較單純PTC低，本實(shí)驗(yàn)中PTC合并HT的BRAF V600E蛋白陽性率低于單純PTC組(59.71%vs69.94%，P=0.032)，與分子水平檢測(cè)結(jié)論一致。但在PTC合并HT中，BRAF突變對(duì)預(yù)后的影響仍存在爭議。發(fā)病年齡為甲狀腺腫瘤TNM分期的關(guān)鍵因素，<55歲患者即使出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也被分為Ⅱ期，預(yù)后較好。本實(shí)驗(yàn)中PTC合并HT組中BRAF V600E蛋白陰性組的發(fā)病年齡比BRAF V600E蛋白陽性組的發(fā)病年齡小(38.88歲vs43.54歲，P=0.019)且<55歲患者年齡占比高(92.86%vs75.90%，P=0.009)，可能提示BRAF V600E蛋白陰性組的預(yù)后好于陽性組。目前PTC合并HT的相關(guān)文獻(xiàn)中研究BRAF V600E突變對(duì)臨床病理特征的影響多是在分子水平檢測(cè)核酸的變化來判定BRAF基因突變。如Dong等[15]的一項(xiàng)研究指出PTC合并HT中如出現(xiàn)BRAF V600E突變則提示為腫瘤多發(fā)的指標(biāo)之一；Zeng等[16-17]均認(rèn)為PTC合并HT中即使發(fā)生了BRAF V600E突變，與單純PTC相比其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，為PTC的保護(hù)性因素。本實(shí)驗(yàn)在蛋白水平檢測(cè)BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)，并未發(fā)現(xiàn)BRAF V600E蛋白表達(dá)與腫瘤多發(fā)和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。是否由于PTC合并HT中BRAF V600E突變率較低而使HT成為PTC的保護(hù)性因素，仍需進(jìn)一步探討。PTC合并HT中還存在RET/PTC原癌基因重排、PI3K/Akt通路激活等，HT和BRAF與這些通路之間有無共同影響也需進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)首次通過直接分析BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)情況，探討其對(duì)PTC合并HT臨床病理特征的影響，結(jié)果表明與單純PTC患者相比，PTC合并HT患者BRAF V600E蛋白的陽性率低；HT或BRAF V600E蛋白表達(dá)均與腫瘤大小、腫瘤多發(fā)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步在分子水平研究PTC合并HT中BRAF V600E蛋白同其他分子通路的關(guān)系，以期闡明PTC與HT共存的分子機(jī)制，為指導(dǎo)診治提供理論支持。