基于GC-MS技術(shù)分析日本血吸蟲(chóng)寄生對(duì)釘螺代謝產(chǎn)物的影響

吳志蕾，何紫薇，胡 雙，石蓮琴，楊建發(fā)，鄒豐才，黃翠琴

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；3. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 360012）

0 引言

【研究意義】日本血吸蟲(chóng)病是由日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）引起的一種嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的寄生蟲(chóng)病。湖北釘螺（Oncomelania hupensis）是日本血吸蟲(chóng)的唯一中間宿主，消滅釘螺是控制血吸蟲(chóng)病的重要措施。因此，研究釘螺代謝物及其與日本血吸蟲(chóng)寄生的關(guān)系，揭示日本血吸蟲(chóng)與釘螺互作機(jī)制，可為生物滅螺提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 代謝組學(xué)主要研究平臺(tái)包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CE/MS）和核磁共振等[1]。目前代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物開(kāi)發(fā)、營(yíng)養(yǎng)代謝等方面，在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域得以應(yīng)用[2]。陳璐[3]運(yùn)用核磁共振技術(shù)與多變量數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的代謝組學(xué)方法，分析了減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠的代謝組的影響，為進(jìn)一步了解宿主-多病原體相互作用提供了數(shù)據(jù)。Wang 等[4]應(yīng)用核磁共振（NMR）技術(shù)分析了日本血吸蟲(chóng)單獨(dú)感染引發(fā)的宿主代謝上的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明宿主尿樣中馬尿酸、乙酸和三羧酸循環(huán)（TCA）中間產(chǎn)物下降，丙酮酸和腸道菌群相關(guān)代謝物含量下降。Wu等[5]進(jìn)一步研究了日本血吸蟲(chóng)感染小鼠整個(gè)過(guò)程的體液和肝臟組織的代謝動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果說(shuō)明小鼠感染后出現(xiàn)脂代謝紊亂、抑制TCA、促進(jìn)糖酵解和腸道菌群失調(diào)等，還在尿樣中發(fā)現(xiàn)與血吸蟲(chóng)病嚴(yán)重程度相關(guān)的特征性代謝產(chǎn)物3-脲基丙酸。越來(lái)越多的學(xué)者把代謝組學(xué)應(yīng)用到弓形蟲(chóng)、雞球蟲(chóng)和微孢子蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)研究方向，為寄生蟲(chóng)病的早期預(yù)警和診斷提供基礎(chǔ)，并為寄生蟲(chóng)病的防治提供重要依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】日本血吸蟲(chóng)是公共衛(wèi)生研究的重要內(nèi)容，過(guò)去一直從血防的角度來(lái)預(yù)防該病的發(fā)生與傳播，但仍未能根除該病。對(duì)釘螺的研究，始終停留在日本血吸蟲(chóng)中間宿主的角度來(lái)探索。目前殺滅釘螺的措施主要有藥物滅螺、生態(tài)滅螺和生物滅螺。化學(xué)藥物殺螺效果較為理想，但藥物對(duì)人和動(dòng)物及環(huán)境都存在健康危害。在毛蚴感染釘螺后，釘螺會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)毛蚴及其本身生存的代謝產(chǎn)物，若用其自身的抑制劑研制新型滅螺藥，有可能切斷日本血吸蟲(chóng)在釘螺體內(nèi)的發(fā)育，能更有針對(duì)性的消滅陽(yáng)性釘螺，保持生態(tài)平衡?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用GC-MS技術(shù)分別對(duì)有血吸蟲(chóng)尾蚴寄生的釘螺和沒(méi)有尾蚴寄生的釘螺進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選兩者間的差異代謝產(chǎn)物，探索日本血吸蟲(chóng)入侵釘螺后的相互作用和代謝通路，為后續(xù)釘螺的生物控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本分組

湖北釘螺樣本由江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所饋贈(zèng)，均采集自野外山地、田地溝渠等適宜釘螺生存的自然環(huán)境。選擇其中活性較強(qiáng)的釘螺進(jìn)行鏡檢觀察，辨別陽(yáng)性釘螺和陰性釘螺。分別收集陽(yáng)性釘螺Y組和陰性釘螺W組，每5只釘螺組織為一個(gè)樣本，每組設(shè)6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，隨后送至上海百趣生物公司（www.biotrre.cn）提取釘螺代謝物，并進(jìn)行GC-TOF-MS代謝組學(xué)檢測(cè)分析。

1.2 主要儀器

GC色譜儀（Agilent 7890A，Agilent，USA），質(zhì)譜 儀 （LECO Chroma TOF PEGASUS HT，LECO，USA），研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）。

1.3 主要試劑

L-2-氯苯丙氨酸，購(gòu)自上海恒柏生物科技有限公司；硅烷化試劑（BSTFA），含1%三甲基氯硅烷（TMCS，v/v），購(gòu)自REGIS Technologies. Inc. USA；代謝物提取液：甲醇、乙腈、丙酮、水的體積比為30∶30∶30∶10。

1.4 樣品處理

1.4.1 釘螺鏡檢 （1）用滅菌4%生理鹽水清洗釘螺3遍；（2）把釘螺置于載玻片，用另一片載玻片壓破釘螺殼，加一滴生理鹽水鏡檢；（3）在顯微鏡下觀察是否有日本血吸蟲(chóng)胞蚴或尾蚴的存在。發(fā)現(xiàn)胞蚴或尾蚴的釘螺為陽(yáng)性釘螺，未發(fā)現(xiàn)的為陰性釘螺；（4）每5只陽(yáng)性釘螺、5只陰性釘螺各為1份樣品組，陰陽(yáng)性釘螺各提供6份樣品組（30個(gè)釘螺），置于凍存管中備用提取代謝物，或在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 釘螺代謝物的萃取 取50 mg去殼釘螺全臟器組織樣本于2 mL離心管中，加入0.4 mL提取液（甲醇、氯仿體積比為3∶1），再加入20 μL L-2氯苯丙氨酸，漩渦混勻[6]。在離心管中加入鋼珠，40 Hz研磨儀處理4 min，冰浴條件下超聲5 min。超聲結(jié)束立即將樣本置于 4℃，12 000 r·min-1離心5 min。隨后取出0.34 mL上清于2 mL進(jìn)樣瓶（甲烷硅基化的）中。干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑，混勻后放入烘箱中80°C孵育0.5 h[7]。隨后每個(gè)樣品中加入100 μL BSTFA，將混合物70°C孵育2 h。

1.4.3 代謝物上機(jī)檢測(cè) 將已提取好的代謝物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，上機(jī)條件：Agilent 7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS 具體分析條件如下：進(jìn)樣量1 μL，為不分流模式；載氣為氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速是3 mL·min-1；柱流速是1 mL·min-1；柱溫在 50°C 保持1 min，再以 10°C·min-1的速率上升至290°C，保持7 min；前進(jìn)樣口溫度280°C；傳輸線溫度270°C；離子源溫度 220°C；電離電壓-70 eV；掃描方式為30-600 m/z，掃描速率20 spectra/sec；溶劑延遲460 s[8]。

1.5 代謝物檢測(cè)方法

采用LECO公司的Chroma TOF2.3X軟件和LECOFiehnRtx5數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行原始峰定性和定量，再將所得的GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行噪音數(shù)據(jù)過(guò)濾，使用內(nèi)標(biāo)歸一法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[9]。過(guò)濾得到的峰面積導(dǎo)入SIMCA軟件（V14，Umetrics AB，Umea，Sweden），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析。采用主成分分析（PCA）、正交矯正偏最小二乘法（OPLS-DA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行總覽和判別分析。最后根據(jù)變量重要投影值VIP（Variable Importance in the Projection）＞1和t檢驗(yàn)P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選代謝產(chǎn)物[10]。

1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用LECO/Fiehn代謝組學(xué)文庫(kù)鑒定化合物，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的提取和過(guò)濾，目的是除去噪音數(shù)據(jù)。之后通過(guò)SIMCA軟件，對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析[11]。本試驗(yàn)中用主成分分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)建模分析，用正交矯正偏最小二乘法判別分析方法最大化地凸顯模型內(nèi)部與預(yù)測(cè)主成分（Predictive component）相關(guān)的差異，最后結(jié)合t檢驗(yàn)的P值來(lái)篩選差異性表達(dá)代謝物，分析代謝特征[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測(cè)

由內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）保留時(shí)間（Retention time，min）來(lái)衡量，從表1中數(shù)據(jù)可以看到，其標(biāo)準(zhǔn)差為：0.001 771，說(shuō)明系統(tǒng)十分穩(wěn)定。

2.2 代謝組學(xué)譜圖分析

對(duì)2組共12個(gè)樣本的釘螺提取的代謝物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)后，獲得所有樣本的總離子流色譜圖（Total ion chromatogram，TIC）（圖 1），橫坐標(biāo)表示出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)表示峰高，峰越高，表明物質(zhì)含量越多，強(qiáng)度越大。每個(gè)峰對(duì)應(yīng)一個(gè)或幾個(gè)組分，圖上有大量的峰，表示檢測(cè)出了大量不同物質(zhì)。得到的總離子流色譜圖表明釘螺組織樣本品質(zhì)良好，峰面積可進(jìn)行下一步分析。

表1 內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）保留時(shí)間Table1 Retention time of internal standard （L-2-chlorophenylalanine）

2.3 差異代謝物篩選

采用OPLS-DA模型第一主成分的變量重要投影值VIP＞1標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果以P＜0.05判定為兩組有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此確定差異代謝產(chǎn)物。多元變量統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別后，過(guò)濾掉不相關(guān)的正交信號(hào)，利用上述方法篩選差異性表達(dá)代謝物[12-13]。

表2中的相似度表示與LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)中的匹配度，相似度＞700則鑒定為可信代謝物，相似度＜200為不確定代謝物，相似度在200～700為假定注釋。通過(guò)VIP值和t檢驗(yàn)對(duì)代謝物進(jìn)行篩選，及其在載荷圖中對(duì)應(yīng)編號(hào)，在508個(gè)峰中篩選得到18種差異代謝產(chǎn)物，按差異從大到小排序?yàn)椋罕郊状?、蔗糖、鄰苯二甲酸二辛酯?-氨基戊酸、3-羥基丁酸、葉綠醇、胞嘧啶、酵母氨酸、鳥(niǎo)嘌呤、2-單棕櫚酸甘油酯、4-乙酰氨基丁酸、花生四烯酸、D-阿拉伯糖醇、2,4-二氨基丁酸、4-氨基丁酸、脯氨酸、纈氨酸和瓜氨酸（表2）。

從表2可以看出，在508個(gè)釘螺代謝產(chǎn)物中共篩選到18種差異代謝產(chǎn)物，其在陽(yáng)性釘螺中的含量均遠(yuǎn)低于陰性釘螺，陽(yáng)性釘螺中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯升高的物質(zhì)，結(jié)果表明日本血吸蟲(chóng)寄生對(duì)釘螺的生理代謝產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，其中對(duì)釘螺代謝功能影響較明顯的有以下11種代謝物。

（1）苯甲醇：陰、陽(yáng)性釘螺之間差異最大的代謝產(chǎn)物是苯甲醇，陰性組中的含量是陽(yáng)性組的765倍。苯甲醇可以影響生物降解以及葡萄糖的降解，其含量變化會(huì)影響糖代謝過(guò)程[14]。

（2）D-阿拉伯糖醇：D-阿拉伯糖醇的減少也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法正常抑制蔗糖的代謝與吸收，抑制血糖升高和脂肪生長(zhǎng)[15]，表明陽(yáng)性釘螺糖代謝途徑嚴(yán)重受阻，導(dǎo)致機(jī)體能量負(fù)平衡。

圖1 全部12組釘螺樣本的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of 12 O. hupensis specimens

（3）鄰苯二甲酸二辛酯：有類似雌激素的作用，是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物，陽(yáng)性組中含量降低會(huì)影響釘螺生殖功能。

（4）4-氨基丁酸：屬于非蛋白氨基酸，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)節(jié)激素分泌[16]，是三羧酸循環(huán)的重要組成部分，其含量降低嚴(yán)重影響機(jī)體能量循環(huán)過(guò)程，導(dǎo)致碳氮平衡失調(diào)[17]。

（5）3-羥基丁酸：具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[18]，其含量的減少也會(huì)嚴(yán)重紊亂機(jī)體能量代謝[19]。

（6）胞嘧啶：與脂類中某些磷脂的合成密切相關(guān)[20]，其含量的異?？捎绊懼惖暮铣纱x。

（7）酵母氨酸：作為賴氨酸合成與分解代謝途徑的中間物質(zhì)，酵母氨酸減少反映出賴氨酸含量的變化，而賴氨酸是參與機(jī)體能量代謝和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要氨基酸之一[21]，表明血吸蟲(chóng)寄生嚴(yán)重阻礙了釘螺自身能量代謝功能，掠奪其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

（8）2-單棕櫚酸甘油酯：參與脂肪代謝，其含量的改變影響了脂肪正常的合成與分解。

（9）2,4-二氨基丁酸：是一種神經(jīng)酰胺受體，可引起神經(jīng)毒性，也是細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其含量的降低會(huì)影響細(xì)胞的穩(wěn)定性。

（10）脯氨酸：是機(jī)體重要能量來(lái)源，其代謝可以及時(shí)提供充足能量，并對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)有著保護(hù)的功能；脯氨酸又是膠原蛋白主要組成成分，參與傷口愈合和組織修復(fù)，與免疫機(jī)制相關(guān)聯(lián)[22]，陽(yáng)性組脯氨酸含量降低導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓失去平衡，肝細(xì)胞發(fā)生水泡樣變性。

（11）纈氨酸：是合成一種免疫抗生素的重要中間體，能夠抑制蛋白質(zhì)的分解[23]，其含量的異常影響了蛋白質(zhì)的合成分解。

3 討論

3.1 日本血吸蟲(chóng)寄生對(duì)釘螺代謝影響分析

關(guān)于寄生蟲(chóng)與宿主的相互作用，學(xué)者大都認(rèn)同，寄生蟲(chóng)的寄生會(huì)影響宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與能量代謝。本試驗(yàn)結(jié)果也表明：陽(yáng)性釘螺中差異代謝物的含量比陰性釘螺低幾倍甚至幾百倍，血吸蟲(chóng)寄生造成釘螺糖代謝、能量代謝等正常功能發(fā)生障礙，損傷機(jī)體，可導(dǎo)致陽(yáng)性釘螺死亡。

18種差異代謝物中，大多數(shù)物質(zhì)都與機(jī)體糖代謝相關(guān)，其次是能量代謝。日本血吸蟲(chóng)寄生釘螺后，這幾種代謝物含量有所減少，使釘螺無(wú)法正常維持機(jī)體免疫系統(tǒng)和酸堿度平衡，無(wú)法幫助肝臟排除氨毒，平衡血糖和膽固醇。導(dǎo)致宿主能量和營(yíng)養(yǎng)的缺乏，糖代謝會(huì)異常加快使得釘螺體內(nèi)糖貯存消化加速。另外，蔗糖和3-羥基丁酸與機(jī)體的能量代謝相關(guān)。蔗糖是重要的能量載體及來(lái)源，有機(jī)物合成應(yīng)用到大部分原料，都需要由蔗糖裂解提供碳架，是生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的重要化合物[24]，其含量的異常影響了個(gè)體的生長(zhǎng)和發(fā)育。3-羥基丁酸有著抑制細(xì)胞凋亡的作用[25]，其含量的減少也會(huì)嚴(yán)重紊亂能量代謝的功能。由此可見(jiàn)，日本血吸蟲(chóng)尾蚴寄生釘螺后搶奪其營(yíng)養(yǎng)和能量，嚴(yán)重紊亂釘螺的生理代謝功能。

3.2 從代謝學(xué)角度分析釘螺防治前景

日本血吸蟲(chóng)病不僅危害人畜健康，還對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重危害。雖然過(guò)去一直從血防的角度來(lái)根治該病的發(fā)生與傳播，但仍未能去除該病。該寄生蟲(chóng)病地域性危害嚴(yán)重，并且缺乏快速簡(jiǎn)易的診斷方法和有效的疫苗和藥物，好在控制和研究其唯一的中間宿主釘螺，可以有效防控該病的發(fā)生與傳播[26]。然而，傳統(tǒng)的滅螺手段不僅給人類和其他生物帶來(lái)致畸形、致癌等危害，還會(huì)影響環(huán)境和生態(tài)平衡。所以，需要研制新的滅螺藥劑。本研究證實(shí)日本血吸蟲(chóng)的寄生對(duì)宿主釘螺的代謝、生長(zhǎng)、生存和繁殖能力等造成不利影響，能否成功寄生則表現(xiàn)為釘螺與日本血吸蟲(chóng)的相容性。日本血吸蟲(chóng)毛蚴入侵釘螺軟體后，經(jīng)母胞蚴發(fā)育、子胞蚴發(fā)育、尾蚴成熟逸出幾個(gè)階段，這個(gè)過(guò)程中釘螺會(huì)釋放出類黏液性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，稱為毛蚴松[27]，其能否在釘螺體內(nèi)生存取決于日本血吸蟲(chóng)侵襲能力與宿主相互作用的結(jié)果[28]。釘螺宿主由于被寄生所導(dǎo)致的死亡或生殖能力下降等影響在遺傳進(jìn)化上也具有重要意義。

日本血吸蟲(chóng)在釘螺體內(nèi)的寄生機(jī)制極其復(fù)雜，深入了解寄生蟲(chóng)與宿主之間的寄生關(guān)系可對(duì)其控制、防治提供有力依據(jù)。雖然，本次研究未能明確探索出可抑制血吸蟲(chóng)毛蚴在釘螺體內(nèi)寄生的代謝物質(zhì)，但為日本血吸蟲(chóng)和釘螺的防控研究提供了新思路，今后將從代謝組學(xué)角度開(kāi)展更深一步研究。