鐵觀音茶樹甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(CsGPAT)基因克隆及萎凋過程中的表達分析

畢婉君，周子維，武清楊，鄭玉成，倪子鑫，柳鎮(zhèn)章，孫 云

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】鐵觀音（Camellia sinensis var. sinensis cv.Tieguanyin）原產(chǎn)福建省泉州市安溪縣西坪鎮(zhèn)，是國家優(yōu)良茶樹品種[1-2]；其抗性強，適制烏龍茶，香氣高長持久，具有獨特的蘭花香，是中國十大名茶之一。鐵觀音中的脂肪族類香氣物質(zhì)是組成其獨特香氣的成分之一[3]，茶葉加工過程中合成脂肪族類香氣物質(zhì)的前體物質(zhì)是以亞油酸、亞麻酸為代表的不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸是磷酸的組成部分，磷脂類物質(zhì)是甘油磷酸代謝途徑（Glycerophospholipid metabolism）的最終產(chǎn)物。甘油磷脂代謝過程有許多酶的參與，其中甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）是參與反應的第一個轉(zhuǎn)移酶[4]，它催化?；o酶A上的脂肪酸與sn-甘油結(jié)合，形成1-?；?sn-甘油-3-磷酸[5-7]。此外，GPAT基因是植物中的抗性基因，低溫脅迫使其表達量增加，一定程度上影響細胞膜上的不飽和脂肪酸含量[8-9]。不飽和脂肪酸的含量和膜脂流動性成正比，膜脂流動性增強使得植物抵御寒冷的能力增強[10-11]。萎凋是烏龍茶加工的關(guān)鍵步驟，相對低溫萎凋會促使茶葉香氣物質(zhì)形成，從而影響茶葉品質(zhì)[12]?！厩叭搜芯窟M展】目前，GPAT基因已在擬南芥[13]、油茶[14]、油菜[15]、油桐[16]、番茄[17]等多種植物中克隆。在模式生物擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10個AtGPAT基因家族成員，它們各自參與脂質(zhì)生物合成的途徑[18-19]；陳麗靜等[20]以王百合為試驗材料，發(fā)現(xiàn)GPAT基因表達量隨著冷誘導時間增加而增加，表明GPAT基因和植物抗寒性相關(guān)；皮廣靜等[21]對花生油脂合成進行探究，發(fā)現(xiàn)花生含油量與GPAT基因3個時期平均表達量呈顯著性相關(guān)，表明GPAT基因和油脂合成相關(guān)；在擬南芥花粉發(fā)育時期，AtGPAT1/2基因共同影響擬南芥的結(jié)實率[22]，表明GPAT基因在植物育種中有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c】鐵觀音作為我國優(yōu)良茶樹品種，成品茶的香氣馥郁芬芳，GPAT基因是合成脂肪類香氣途徑的上游基因，雖然GPAT基因已經(jīng)在許多植物中克隆，并證實其在植物抗寒性、油脂合成、育種中有重要作用，但是在茶樹中的相關(guān)研究還很少，尤其是在茶葉加工過程中表達量分析的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗用鐵觀音萎凋葉為試驗材料，通過克隆CsGPAT基因，分析其在不同溫度下的表達量，以期能為茶樹萎凋工藝中溫度調(diào)控提供理論依據(jù)，為抗性基因在鐵觀音茶葉萎凋工藝過程中的實際應用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2018年4月份，在福建農(nóng)林大學南區(qū)教學茶場，選取3～4片小開面完整并且無病蟲害的鐵觀音茶樹葉片進行不同溫度萎凋處理。鮮葉萎凋在不同溫度的恒濕箱中進行處理，溫度分別是20℃、30℃、40℃，記做T20、T30、T40，控制萎凋濕度為60 %，攤?cè)~厚度10 mm，萎凋時間60 min，萎凋葉光澤消失，葉色轉(zhuǎn)暗綠色，發(fā)出輕微青草香，含水率為（68.4±1.3）%。處理后用錫箔紙進行密封，用液氮速凍法進行處理，放置-80℃儲藏，用于后續(xù)RNA提取。

1.1.2 試驗主要試劑 75 %乙醇（DEPC-H2O配置），交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），Golden DNA聚合酶，pMD18-T載體，DH-5α感受態(tài)細胞，DreamTaqGreen酶，GelGreen熒光核酸凝膠染色試劑，D2000 DNA Ladder，TIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，引物委托廈門閩博生物技術(shù)有限公司合成，測序委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.1.3 試驗主要儀器 移液器、微量臺式離心機、高速冷凍離心機、超微量核酸檢測儀、電泳儀、凝膠成像儀、BIO-RAD PCR擴增儀、OSE-PRO程控金屬浴、超凈工作臺、Roche Light Cycler?480 PCR實時熒光定量儀、制冰機。

1.2 基因克隆方法

1.2.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測 取鐵觀音T20、T30、T40處理萎凋后無病蟲害的完整葉片為試驗材料，按照TIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒步驟，提取鐵觀音茶樹總RNA。用1%瓊脂糖凝膠對其進行電泳檢測，確定其完整性，然后用超微量核酸檢測儀對其OD值進行檢測，選擇符合試驗結(jié)果的RNA用于后續(xù)試驗。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄 以符合要求的總RNA為試驗材料，采用GeneRacer Kit試劑盒的方法合成cDNA第一鏈。參照林玉玲[23]逆轉(zhuǎn)錄的方法，第一步是RNA的去磷酸化；第二步是mRNA去帽子結(jié)構(gòu)；第三步是RNA接頭鏈接；第四步是反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 PCR引物設計 根據(jù)已知序列設計3′RACE和5′RACE引物（表1），用于PCR巢式擴增試驗。基于測序獲得甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）基因ORF序列，利用DNAMAN 6.0軟件選擇具有差異的區(qū)域設計保守區(qū)的特異性上下游引物，用于RT-qRCR試驗（表2）。

表1 3′RACE和5′RACE所使用的引物Table1 Primers used in 3′ RACE and 5′ RACE

表2 實時熒光定量基因表達分析的引物序列Table2 Primer sequence for real-time fluorescence quantitative gene expression analysis

1.2.4 目的片段的擴增、回收、克隆與測序 用獲得的cDNA第一鏈為模板，GPAT-F、GPAT-R為引物，通過常規(guī)的PCR擴增技術(shù)獲得鐵觀音茶樹的GPAT基因目的片段。用購自TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaqTM（Code NO.RR716）試劑盒，并且配合使用Roche LightCycler?480實時熒光定量PCR儀，嚴格按照其步驟，進行qRT-PCR。qRT-PCR反應體系為20 μL，配置用量：10 μL 2×SYBR Premix ExTaq、0.8 μL 200 nmol·L-1的上下游引物、2 μL cDNA 模板、6.4 μL ddH2O。qRT-PCR反應程序（兩步法）為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min；53℃退火40 s；72℃延伸45 s，共45個循環(huán)，72℃延伸10 min。得到目的產(chǎn)物進行電泳鑒定。采用 TaKaRa公司提供的試劑盒上的實驗步驟回收目的條帶，將得到的目的條帶連接到pMD-18 T載體上，對其做PCR擴增檢驗，交由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序。

1.2.5 目的基因表達量定量測定 反應結(jié)束后進行擴增曲線和熔解曲線分析，標準曲線每個梯度均進行3次重復，其中 cDNA模板為各個樣本cDNA混合樣的5倍梯度稀釋，以滅菌蒸餾水作為陰性對照。

采用qRT-PCR儀采集的數(shù)據(jù)做熔解曲線。選用單內(nèi)參方法，選用CsEF-1α為內(nèi)參基因，設計引物如表2所示，用于實行熒光定量PCR[24]。對比CK樣品的數(shù)據(jù)，使用 Excel辦公工具，通過2-ΔΔCt公式計算鐵觀音茶樹葉中影響低溫脅迫的目的基因（GPAT）在不同萎凋溫度時的相對表達量。接著使用DNAman軟件設計目的基因的特異性引物見表1。

1.2.6 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站的BlastP工具對克隆得到的CsGPAT基因進行氨基酸序列的相似性和同源性查找，并利用這些序列進行氨基酸序列同源性比較。然后將這些序列下載下來保存為fasta格式，采用MEGA-X軟件進行系統(tǒng)發(fā)生和進化分析，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbour-Joining（距離鄰接法）構(gòu)建。

1.2.7 序列分析及生物信息學分析 編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)預測利用ExPASy Protparam（http://www.expasy.ch/tools/protparam.htmL）分析完成；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域預測通過SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）分析完成；亞細胞定位情況預測分別通過SignalP 4.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）和 PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/）以 及prediction protein（https://www.predictprotein.org/home）分析完成；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測通過prediction protein（https://www.predictprotein.org/home）完成；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測通過SWISS-MODEL在線工具（http://www.swissmodel.expasy.org/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀音茶樹總RNA質(zhì)量的檢測和cDNA擴增序列的獲取

用1%瓊脂糖凝膠對得到的鐵觀音茶樹總RNA做電泳測定，測得結(jié)果顯示，總RNA條帶無缺失、無拖尾現(xiàn)象，表明RNA基本無降解。用超微量核酸檢測儀檢測其OD值判斷其純度，OD260/280在1.8-2.2范圍內(nèi)，表明提取的總RNA純度較高，達到試驗標準。測序表明，GPAT基因的5′-RACE PCR產(chǎn)物長度約為100 bp，3′-RACE PCR長度約為250 bp（圖1）。用獲得的 cDNA第一鏈為模板，進行常規(guī)PCR技術(shù)擴增鐵觀音茶樹GPAT基因中間保守區(qū)，獲得在1 554 bp的基因片段（圖1）。

2.2 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息學分析

2.2.1 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析 通過ExPASy Protparam預測網(wǎng)站，對該蛋白質(zhì)序列進行基本理化性質(zhì)分析，并得出結(jié)論。該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為55.15 kD，理論等電點（pI）的值為9.3，發(fā)現(xiàn)原子構(gòu)成為 C2519H4025N655O691S19，原子總個數(shù)為7 909，共有108個帶電荷氨基酸，其中有46個氨基酸（Asp+Glu）帶有負電荷，剩下62個氨基酸（Arg+Lys）帶正電荷，蛋白質(zhì)序列不穩(wěn)定系數(shù)為36.49，表明該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。對其蛋白質(zhì)在不同部位的半衰期分析后發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物紅細胞、酵母細胞、大腸桿菌細胞中的半衰期分別為30 h、20 h和10 h?？偲骄H水性（GRAVY）0.123，為疏水性蛋白。

2.2.2 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域預測與分析 通過預測分析后得出：GPAT蛋白質(zhì)序列中一共含有3個功能域，分別是pfam域、跨膜螺旋區(qū)域和SMART PlsC域。其中pfam域處于23～203位氨基酸，跨膜螺旋區(qū)域處于242～264位氨基酸，SMART PlsC域處于301～402位氨基酸。SMART PlsC域又名為磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶，具有磷脂生物合成功能，具有磷酸甘油、1-酰基甘油磷酸酯或2-?；视土姿嵋掖及滨；D(zhuǎn)移酶活性。所以SMART PlsC域是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因的主要功能區(qū)域，也是該基因重要組成部分，合成磷脂生物是PlsC域的本質(zhì)特征，因此該蛋白具有磷脂生物合成功能。

2.2.3 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)信號肽與亞細胞定位分析 對GPAT蛋白的結(jié)構(gòu)運用SignalP 4.1 Server進行預測，結(jié)果如圖2所示。信號肽是一段特殊的氨基酸序列，其功能是在新合成的多肽鏈中，對蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移進行有效指導。蛋白質(zhì)信號肽及其斷裂位點預測結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)不含信號肽（圖2）。亞細胞定位對生物學功能有一定影響，通過PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/）軟件進行預測，結(jié)果顯示，對GPAT蛋白質(zhì)在細胞中定位分析后，得出其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的定位分值為44.4 %、質(zhì)膜定位分值為22.2 %、液泡、線粒體、高爾基體的定位分值為11.1 %，表明其很有可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis analysis on PCR products

圖2 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的信號肽預測結(jié)果Fig.2 Prediction of signal peptide in GPAT protein

2.2.4 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測與分析 對GPAT蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)運用prediction protein軟件進行預測，從而使得可以更加直接清晰地理解GPAT基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在鐵觀音茶葉中的存在情況。結(jié)果表明多肽鏈中有規(guī)則構(gòu)象主要有兩種，分別是α-螺旋和β-折疊。α-螺旋、β-折疊的比例分別為39.03 %和16.50 %。其還包含無規(guī)則卷曲狀態(tài)，所占比例為44.47 %。通過SWISS-MODEL在線工具對其進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測進一步說明蛋白質(zhì)的功能（圖3）。

圖3 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測Fig.3 Predicted 3D structure of GPAT protein

2.2.5 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)同源性分析 對鐵觀音茶葉中檢測得到的GPAT基因編碼得到的氨基酸序列做同源性分析，在 GenBank庫中尋找篩選出其他植物的GPAT基因編碼的氨基酸序列與鐵觀音物種的GPAT氨基酸序列進行比較。結(jié)果表明，CsGPAT氨基酸序列與胡楊（Populus euphratica）、毛果楊（Populus trichocarpa）、中華獼猴桃（Actinidia chinenesis var. chinensis） 、棉花（Gossypium hirsutum）的GPAT氨基酸序列相似度較高，分別是87.53 %、86.72 %、87.55 %、86.52 %。進化樹通過GPAT蛋白序列組成，系統(tǒng)進化樹顯示鐵觀音茶樹GPAT與油茶（Camellia oleifera）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.3 鐵觀音不同溫度萎凋過程中CsGPAT基因的表達分析

圖4 NJ法構(gòu)建的GPAT氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of GPAT amino acid sequence constructed by NJ method

通過實時熒光定量PCR技術(shù)，對鐵觀音萎凋過程中茶葉甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因的相對表達量變化進行檢測。分析結(jié)果顯示在鐵觀音萎凋過程中，CsGPAT基因的相對表達量在萎凋溫度20℃時達到最高，當萎凋溫度達到30℃和40℃時，該基因表達量被顯著抑制表達（圖5）。對CsGPAT基因的相對表達量用SPSS進行差異性分析，結(jié)果表明室溫表達量和20℃、30℃、40℃萎凋表達量存在極顯著差異，20℃萎凋表達量和30℃、40℃萎凋表達量也存在極顯著差異，30℃和40℃萎凋表達量之間不存在差異性。表明CsGPAT基因的相對表達量與溫度密切相關(guān)，相對低溫環(huán)境會促進CsGPAT基因表達。

圖5 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因在不同萎凋溫度下的相對表達量Fig.5 Relative expressions of CsGPAT at different withering temperatures

3 討論與結(jié)論

本研究通過巢式PCR克隆得到1個長度為1 554 bp的鐵觀音茶樹甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（GPAT），編碼497個氨基酸。GPAT的結(jié)構(gòu)特征是具有磷脂生物合成功能的SMART PlsC結(jié)構(gòu)域，大部分植物GPAT具有這種結(jié)構(gòu)域，說明GPAT基因與磷脂生物合成密切相關(guān)。GPAT是甘油磷脂代謝途徑的第一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)移酶，最終合成磷脂類物質(zhì)是不飽和脂肪酸香氣的前體物質(zhì)。在植物受到逆境脅迫時，GPAT基因的表達量會隨著溫度下降而上調(diào)，說明CsGPAT與溫度調(diào)控存在重要關(guān)系，同時可能對于茶葉加工過程中香氣形成有一定作用。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因家族具有Phospholipid/glycerol acyltransferase蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，在茶樹（阿薩姆種，CSA）基因組中共有20個拷貝數(shù)（IPR002123），在茶樹（中國種，CSS）中則存在9個拷貝數(shù)（EC：2.3.1.15）。本研究基于茶葉萎凋過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選獲得了一條GPAT相關(guān)基因（IDcsa:CSA000941.1/IDcss:TEA019813.1）。目前，茶樹基因組數(shù)據(jù)庫已經(jīng)公布（http://tpia.teaplant.org/），顯示低溫脅迫會使GPAT基因表達量上調(diào)。

在茶葉加工中，不飽和脂肪酸經(jīng)脂肪氧合酶途徑合成大量脂肪族類香氣物質(zhì)，比如，正己醛、青葉醛、青葉醇、乙酸乙酯、茉莉酸甲酯等[25]，最終影響茶葉品質(zhì)的形成。鐵觀音具有的獨特花香主要由脂類、醇類、醛類揮發(fā)性物質(zhì)組成[1]，GPAT基因促進此類香氣的前體物質(zhì)產(chǎn)生，表明GPAT基因可能作用于鐵觀音香氣的形成。GPAT基因在鐵觀音不同萎凋溫度過程中的表達量分析表明，鐵觀音GPAT基因表達量隨著萎凋溫度的降低而上調(diào)，在萎凋溫度20℃時表達量最高，推測在茶葉萎凋過程中，葉片受到相對低溫脅迫誘導基因表達，有利于脂肪族類香氣物質(zhì)的形成。目前，擬南芥中已鑒定出有10個GPAT家族成員，以擬南芥10個GPAT家族成員蛋白（http://tpia.teaplant.org/#）為種子序列，與本試驗克隆的CsGPAT構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析顯示CsGPAT與AtGPAT4和AtGPAT8的同源性高。前人研究表明AtGPAT4與AtGPAT8與植物角質(zhì)的形成相關(guān)，它們存在?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，還同時存在磷酸化酶結(jié)構(gòu)域[26]。利用在酵母中GPAT-缺失突變體（gatl delta）和/或麥胚無細胞轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進行表達驗證GPAT4催化反應，表明這個酰基轉(zhuǎn)移酶酯化偏愛?；鶊F在G3P的sn-2位，并認為?；D(zhuǎn)移和磷酸酶的雙功能性可能參與角質(zhì)組成單體的組合。植物角質(zhì)層是植物細胞與外界環(huán)境隔離的一道天然屏障，因此過表達GPAT，可能會提高植物的抗逆表現(xiàn)。由此推測茶樹中CsGPAT基因極有可能具有此功能，在茶葉的抗逆性中發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究將通過基因共表達分析，進一步探究GPAT基因在冷脅迫條件下的表達模式，構(gòu)建GPAT基因的調(diào)控網(wǎng)絡。

抗逆性不僅對茶樹的生長發(fā)育十分重要，同時在茶葉加工過程中，茶葉在萎凋中受到相對低溫時的防御反應會影響茶葉香氣的形成，促使茶葉香氣物質(zhì)的增加[27-29]，提高茶葉品質(zhì)，從而增加茶葉經(jīng)濟效益。本研究通過克隆和分析GPAT基因在萎凋過程中的表達分析，初步確認GPAT基因與茶葉加工過程中脂肪族類香氣物質(zhì)合成密切相關(guān)，鐵觀音GPAT基因在不同萎凋溫度中響應表達，為后續(xù)研究甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因在低溫響應中對茶葉香氣形成的調(diào)節(jié)機制方面提供了理論參考。GPAT基因表達可能受溫度調(diào)控，對茶葉萎凋過程中脂肪族類香氣物質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用。