雙孢蘑菇2796凝集素基因的擴增與原核表達

林 勇，肖冬來，劉俊鋒，唐小巒

（1. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院，福建 福州 350101；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】凝集素是一類非免疫起源、無酶活性、可專一識別多糖并與之非共價可逆結(jié)合的蛋白，含有一個或者多個非催化結(jié)構(gòu)，能凝集細胞、沉淀糖蛋白，具有多種生物學、生理學和免疫學功能[1-3]。凝集素具有結(jié)合特異性，能識別細胞內(nèi)、細胞間或組織間的效應分子。凝集素根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可分為C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素。C-型凝集素是依賴Ca2+的凝集素；S-型凝集素可以和β-半乳糖苷鍵特異性結(jié)合；P-型凝集素對6-磷酸甘露糖具有特異識別能力；而I-型凝集素類似于免疫球蛋白。凝集素在動物[4]、昆蟲、植物、真菌以及不同的器官和組織中含量都比較豐富，甚至在細菌和病毒中也有凝集素的報道[5-7]。真菌凝集素普遍存在于大型真菌中，分子量為12～190 kD，一般由2～4個相同亞基組成，是食（藥）用真菌中一種重要的藥理成分，含量豐富，雖然從子實體、菌絲、菌核、孢子等器官中均能提取，但大多數(shù)蘑菇凝集素為從子實體和菌絲中提取，僅少量從菌核中提取，而且不同發(fā)育階段真菌中凝集素的含量也不同[8]。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇、紐扣蘑菇，是一種常見的食用蘑菇，在世界范圍內(nèi)均有栽培種植，其具有風味鮮美、營養(yǎng)豐富等特性，在食用菌市場中占據(jù)著重要份額[9]。【前人研究進展】前人研究表明，凝集素具有促進植物有絲分裂以及防御病蟲害、細胞免疫活性、殺菌、降血壓、活化淋巴細胞、抑制腫瘤生長等功能[10-16]。凝集素參與了高等動物的發(fā)育、癌變以及細胞識別與信息傳遞等重要過程；不僅在動物自身的器官發(fā)育分化與防御機制中有重要作用，而且還能增強高等動物的免疫能力。因此，蘑菇凝集素目前已成為細胞學、腫瘤學以及免疫學領域研究的熱點。吳恩奇和圖力古爾（2006）綜述了蘑菇凝集素的分布、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用與功能、提取方法和應用進展[3]，目前已知大約80%以上蘑菇中的凝集素具有凝血活性[17-18]。張迪等對雙孢蘑菇2796凝集素提取和理化特性的初步研究發(fā)現(xiàn)，該凝集素在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)均保持較高的凝集活性，且不依賴于二價金屬離子[19]，穩(wěn)定性強。目前關于凝集素基因研究的報道較多，主要體現(xiàn)在天南星和石蒜[13]、擬南芥[20]、綠藻石莼屬孔石莼[21]、新疆黃精[22]、家蠶[23]、大豆[24]、荔枝[25]、金針菇[26]、柞蠶[27]、掌葉半夏[28]等植物和昆蟲凝集素基因的克隆和表達研究上，并探索凝集素基因與蘑菇原基形成的關系，挖掘其潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以求闡明子實體形成的分子調(diào)控機理[26]。彭博等（2019）雖對雙孢蘑菇轉(zhuǎn)錄組進行了測序并對褐變相關基因展開挖掘，但并未對凝集素基因進行相關研究[29]。【本研究切入點】而雙孢蘑菇凝集素基因的擴增及原核表達目前尚未有相關研究報道，其基因功能的研究更是缺乏理論依據(jù)。【擬解決的關鍵問題】本研究根據(jù)已報道的雙孢蘑菇凝集素基因序列設計引物，以總DNA為模板擴增雙孢蘑菇凝集素基因，并構(gòu)建原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導表達、Western blot技術鑒定，獲得凝集素重組蛋白，有助于目的基因的深入研究，也為進一步深入挖掘凝集素家族基因、明確其生物學功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 株 雙 孢蘑 菇Agaricus bisporus（Lange）Singer 2796菌株由福建農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供。表達載體pET-28a、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）均由福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶以及其他工具酶均購自上海生工生物工程有限公司；克隆載體pMD18-T Vector Systems購自日本TaKaRa公司，QIAEXⅡ Gel Extration Kit購自QIAGEN公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 雙孢蘑菇基因組DNA的提取 采用CTAB法[30]，從雙孢蘑菇中提取雙孢蘑菇基因組DNA。

1.2.2 引物設計及序列擴增 根據(jù)基因文庫設計特異性擴增引物。引物序列如下：正向引物5′-GG ATCCATGTCTTACACCGTCAGCGTTCG-3′；反向引物 5′-CTCGAGTTATCCGATGATGAGATTGGC-3′。取上述提取的雙孢蘑菇DNA采用PCR法特異擴增基因序列，反應條件為：94℃5 min，預變性；94℃1 min，變性，55℃1 min，退火，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳（TAE電泳緩沖液、電壓120 V）后，與Marker對照判斷無誤后，切下特異性擴增條帶，擴增產(chǎn)物按照QIAEXⅡGel Extration Kit（QIAGEN公司產(chǎn)品）回收純化說明書進行?；厥债a(chǎn)物連接到pMD18-T載體，篩菌驗證后送華大基因測序，最終得到中間質(zhì)粒pMD18-lectin。

1.2.3 凝集素基因原核表達載體的構(gòu)建 將pMD18-lectin和pET28-α原核表達載體限制性內(nèi)切酶XhoI/BamHI進行雙酶切處理。取適量酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，回收產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化至克隆菌株DH5α感受態(tài)中，挑取長出的菌落，進行菌液PCR鑒定，將檢測出目的條帶的菌液提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，最終得到表達質(zhì)粒pET28-lectin。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET28-lectin在大腸桿菌中的誘導表達 取1 μg上述測序鑒定正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入50～100 μL大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。挑取長出的菌落，進行菌液PCR鑒定，得到最終表達菌株。

取上述PCR鑒定正確的菌液30 μL分別接種到含有3 mL新鮮的LK液體培養(yǎng)基的玻璃管中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6，在培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，以誘導外源基因在大腸桿菌中表達。以IPTG培養(yǎng)基作為未誘導的對照。上述處理后的菌液在37℃下250 r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h或更長時間，使外源基因在大腸桿菌中充分表達。

1.2.5 表達產(chǎn)物的Western blot檢測 制備SDS-PAGE凝膠（12%分離膠和5%濃縮膠），分別上樣經(jīng)ITPG誘導的菌體蛋白、未誘導的菌體蛋白以及空白菌體蛋白，電泳至溴酚藍跑出玻璃板即可終止。電泳結(jié)束前30 min，將PDVF在甲醇中浸潤3～10 s，移至電轉(zhuǎn)液中放置20～30 min，在60 V恒壓、4℃條件下轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜上，將電轉(zhuǎn)好的PDVF膜放在離子水中去除SDS，接著用PBST進行洗滌10 min，洗滌4次；5%脫脂奶粉封閉1 h。制備的組氨酸（His）抗體作為一抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST進行洗滌10 min，洗滌4次；用HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST進行洗滌10 min，洗滌4次；洗滌結(jié)束后去除洗滌液，加入DAB染色工作液染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增雙孢蘑菇凝集素基因

通過與雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，凝集素基因不含有內(nèi)含子，所以無需通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增凝集素基因，可直接以雙孢蘑菇總DNA為模板，PCR擴增凝集素基因。根據(jù)基因文庫設計特異性擴增引物。瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果表明，得到大小432 bp的條帶，與目的基因大小一致（圖1）。

2.2 凝集素基因克隆載體的構(gòu)建

割膠回收PCR擴增的凝集素基因，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板后于37℃下培養(yǎng)至克隆菌落出現(xiàn)，挑取菌落搖菌后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定插入片段是否正確。瓊脂糖電泳后觀察酶切結(jié)果，發(fā)現(xiàn)插入片段與PCR產(chǎn)物大小一致（如圖2所示）。陽性克隆送交公司測序。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果序列與GenBank中已知序列高度同源（99%），確定插入片段為雙孢蘑菇凝集素基因，重組質(zhì)粒pMD18-lectin構(gòu)建正確。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測凝集素基因PCR產(chǎn)物Fig.1 Detecting PCR products of lectin gene with agarose gel electrophoresis

圖2 重組質(zhì)粒pMD-lectin雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of pMD-lectin

2.3 雙孢蘑菇凝集素基因表達載體的構(gòu)建

BamHⅠ和XhoⅠ酶切重組子pMD18-lectin，回收插入片段后將其與同樣酶切回收的pET-28α載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板后于37℃下培養(yǎng)至克隆菌落出現(xiàn)，挑取菌落搖菌后提取質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-lectin。重組子pET28-lectin經(jīng)質(zhì)粒PCR確定插入片段大小正確（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pET-lectin的PCR驗證Fig.3 PCR verification of pET-lectin

2.4 凝集素基因在大腸桿菌中的表達

重組子pET28-lectin轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳檢測表達產(chǎn)物。結(jié)果顯示：重組凝集素蛋白在BL21（DE3）中的表達產(chǎn)物大約為18 kDa（圖4）。

圖4 凝集素融合基因表達產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺電泳分析Fig.4 SDS-PAGE on expression product of lectin fusion gene

2.5 表達產(chǎn)物的Western blot分析

原核表達載體中攜帶6個絲氨酸（His）的標簽，其表達的凝集素中亦融合了6個His氨基酸的標簽。所以用6×His抗體可以檢測凝集素的表達情況。結(jié)果表明（如圖5所示），凝集素融合基因的表達產(chǎn)物均能與His抗體特異性結(jié)合，說明凝集素融合基因得到了表達。

圖5 凝集素融合蛋白Western blot分析Fig.5 Western blot on lectin fusion protein

3 討論與結(jié)論

本研究獲得的凝集素基因大小為432 bp，均小于目前已知的荔枝凝集素基因468 bp[25]、新疆黃精凝集素基因550 bp[22]、大豆凝集素基因800 bp[24]、掌葉半夏凝集素基因729～777 bp[28]以及家蠶凝集素基因810 bp[23]，但是凝集素基因序列大小與其生物學功能差異機理目前尚不清楚。本研究應用的pET-28α載體是帶有載體6個His標簽的融合表達系統(tǒng)，而融合蛋白中的His標簽不會影響蛋白的活性，便于蛋白純化。根據(jù)相關研究報道，其他植物凝集素基因中還存在家族成員且同源性較高，通過誘導表達發(fā)現(xiàn)在相同時間、相同濃度的IPTG誘導下，融合蛋白的表達量各不相同[28]，因此，項目組后續(xù)還需通過生物信息學手段進一步挖掘其基因組中家族成員基因及其他潛在的功能基因，為分析雙孢蘑菇子實體形成的分子調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

雙孢蘑菇子實體中存在大量的凝集素，而凝集素的含量和分布與雙孢蘑菇不同的發(fā)育階段也有一定的相關性，在原基期含量很少，在子實體成熟期內(nèi)數(shù)量增加[8]。因此，可以推測在子實體形成過程中凝集素基因的表達量也逐漸增加，凝集素基因的表達量是否與子實體中營養(yǎng)成分含量有關有待進一步研究。大量的研究表明，許多植物中分離的凝集素或被克隆和鑒定出來的凝集素基因表達產(chǎn)物均具有抗蟲活性[31-33,16]，但是凝集素基因相關研究在雙孢蘑菇中未見報道，僅見于提取雙孢蘑菇凝集素對血紅細胞凝集活性的研究[27]。課題組前期開展了雙孢蘑菇凝集素的抗氧化活性、對植物病菌和海洋微藻的抑制等方面的工作，均具有較好的作用效果。因此，本研究后續(xù)研究將重點開展雙孢蘑菇凝集素基因功能方面的工作，比如凝集素基因與雙孢蘑菇品質(zhì)改良基因的相關性研究；同時，雙孢蘑菇凝集素的應用也可借鑒植物凝集素的應用研究方法，特別是通過轉(zhuǎn)基因技術將雙孢蘑菇凝集素基因轉(zhuǎn)化到作物中，發(fā)揮其抗蟲性和抗病性方面的巨大潛力。也可利用基因編輯技術從雙孢蘑菇中克隆編碼具有免疫調(diào)節(jié)或抗腫瘤功能的凝集素基因，通過導入微生物合成重組蛋白并檢測蛋白的免疫或抗腫瘤生理活性，為進一步篩選和開發(fā)新型先導藥物提供依據(jù)。

本研究選擇最常見的雙孢蘑菇作為研究對象，通過PCR擴增雙孢蘑菇凝集素基因，構(gòu)建雙孢蘑菇凝集素基因克隆載體和基因表達載體等手段使雙孢蘑菇凝集素基因在大腸桿菌中表達，為今后穩(wěn)定、大量獲得雙孢蘑菇凝集素奠定基礎，為進一步深入研究凝集素基因和蛋白功能特性提供依據(jù)。