桃膠多糖體內(nèi)外抗氧化作用的研究

蔡延渠,董碧蓮,陳利秋,朱盛山,李苑新,吳燕紅

(廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心,廣東廣州 510006)

近幾年來,在大健康產(chǎn)業(yè)背景下,隨著老齡化、城鎮(zhèn)化及消費(fèi)升級,正推動我國的保健食品和功能性食品快速發(fā)展?！丁敖】抵袊?030”規(guī)劃綱要》的出臺,意味著“健康中國”上升為國家戰(zhàn)略,健康產(chǎn)業(yè)將成為國民經(jīng)濟(jì)支柱性產(chǎn)業(yè)[1]。

桃膠為薔薇科植物桃(PrunuspersicaL. Batsch)或山桃(PrunusdavidianaCarr. Franch)等植物的樹皮受損后分泌出來的半透明物質(zhì)。其主要成分為多糖,含量高達(dá)80%以上[2],同時(shí)含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸等,遇水可膨脹,有一定黏性。由于桃膠為天然產(chǎn)物、營養(yǎng)豐富,有清血降脂、滋補(bǔ)養(yǎng)顏及抗皺嫩膚等功效,同時(shí)具有韌滑、淡甜的特殊口感,逐漸受到廣大消費(fèi)者的喜愛,是保健食品開發(fā)的重要潛在資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃膠樣品 采自貴州習(xí)水縣,經(jīng)廣東藥科大學(xué)李苑新副研究員鑒定為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch分泌的桃膠樹脂;SPF級昆明雄性小鼠60只 體重(20.0±2.0) g,購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,生產(chǎn)許可證號:SYXK(粵)2018-0002;D-無水葡萄糖(批號110833-201707,含量99.9%) 中國食品藥品檢定研究院;維生素C(VC,批號 SLBN3833V) Sigma試劑有限公司;D-半乳糖 上海源葉生物有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Thris)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

UV-1700雙光束紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;FreeZone2.5冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司;LB940多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;BP-211D電子分析天平 德國Sartorius公司;pHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桃膠多糖制備 參考徐燕等[12]及任永升等[13]報(bào)道的方法,并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。將桃膠浸脹、去雜、烘干,粉碎過60目篩,稱取一定量粉末,以水為溶劑(以1%的NaOH溶液調(diào)節(jié)成pH為10.0),按料液比1∶100 (g/mL)、提取時(shí)間4 h、100 ℃提取3次,提取液3500 r/min離心15 min,濾液于75 ℃減壓濃縮至適量,三氯乙酸除蛋白,再透過分子截流量為100000 Da的透析袋,透析液加入95%乙醇至溶液乙醇含量為85%,冰箱4 ℃靜置過夜,取沉淀冷凍干燥,粉碎過100目篩,即得桃膠多糖。

1.2.2 桃膠多糖含量測定 參考蔡延渠等[2]報(bào)道的方法,采用苯酚-硫酸法,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1019 mg/mL),加入純水補(bǔ)足至1.0 mL,分別加入5%苯酚溶液1.0 mL,搖勻后加入濃硫酸溶液6.0 mL,90 ℃水浴25 min,取出冷卻至室溫,于紫外分光光度計(jì)490 nm處測定吸光度值(A),以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、A為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。吸取1 mL桃膠多糖溶液,按以上操作反應(yīng)后測定吸光度值,代入回歸方程計(jì)算含量,結(jié)果以每克樣品中所含葡萄糖當(dāng)量的毫克數(shù)表示(mg/g)。

1.2.3 桃膠多糖清除自由基能力測定

1.2.3.1 對DPPH自由基清除率測定 參考程軒軒等[14]報(bào)道的方法,吸取不同質(zhì)量濃度桃膠多糖溶液(5～10 mg/mL)及0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液各3 mL,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1;另以等量樣品溶液、無水乙醇混勻后測定A2；等量DPPH溶液、純水混勻后測定A0;VC為陽性對照。通過式(1)計(jì)算清除率:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

1.2.3.2 對ABTS自由基清除率測定 參考包騏林等[15]報(bào)道的方法,將ABTS用過硫酸鉀溶解配制成終濃度為7.2 mmol/L,室溫避光反應(yīng)12 h,即ABTS溶液,用前以PBS(pH=7.4)緩沖液稀釋至734 nm處吸光度值A(chǔ)0為0.70±0.02。吸取2 mL不同質(zhì)量濃度桃膠多糖溶液(0.1～0.6 mg/mL)和4 mL ABTS稀釋液,渦旋30 s,室溫避光反應(yīng)10 min,于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)1;VC為陽性對照。通過式(2)計(jì)算清除率:

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

龐莊水庫上游沒有排污口，點(diǎn)源污染基本不會發(fā)生，但也存在。如正在修建的太焦鐵路工程，就出現(xiàn)過污水排入水體情況。

式(2)

1.2.3.3 對OH自由基清除率測定 參考段景峰等[16]報(bào)道的方法,吸取不同質(zhì)量濃度桃膠多糖溶液(0.2～1.2) mg/mL、FeSO4溶液(6 mmol/L)及H2O2(6 mmol/L)溶液各2 mL,混勻靜置10 min;再加入2 mL水楊酸溶液(6 mmol/L),靜置30 min,于510 nm處測定吸光度值A(chǔ)1;另取等量純水代替水楊酸測定吸光度值A(chǔ)2；以純水代替桃膠多糖溶液作為空白對照測定吸光度值A(chǔ)0;VC為陽性對照。通過式(3)計(jì)算清除率:

清除率(%)=[1-(A1-A2)]/A0×100

式(3)

清除率(%)=[1-(A1-A2)]/A0×100

式(4)

1.2.4 總還原力測定 參考袁燕等[19]報(bào)道的方法,吸取不同質(zhì)量濃度桃膠多糖溶液各1 mL,依次加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液(pH=6.6)各2.5 mL,50 ℃水浴20 min,取出冷卻;再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,混勻,3500 r/min離心15 min,取上清液2.5 mL,加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和純水2.5 mL,20 min后于700 nm處測定吸光度值。另以純水為空白、VC為陽性對照。

1.2.5 小鼠體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn) 參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[20]及鄭飛等[21]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法及條件進(jìn)行。

1.2.5.1 劑量設(shè)計(jì)及給藥 環(huán)境溫度(20±2) ℃、相對濕度50%±10%,明暗周期各12 h,自由采食喝水。于實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,隨機(jī)分為6組,12只/組,分別為:空白組、模型組、桃膠多糖組(低劑量2 g/kg、中劑量4 g/kg、高劑量6 g/kg)和VC陽性對照組(0.1 g/kg)。按0.1 mL/10 g進(jìn)行桃膠多糖組及VC陽性對照組灌胃給藥,1 次/d;空白組及模型組給予等量蒸餾水。除空白組注射生理鹽水外,其余組別每天均按1000 mg/kg劑量進(jìn)行頸背部皮下注射D-半乳糖,連續(xù)45 d。每天觀察小鼠體征、外觀、活動等,每3 d稱重1次以調(diào)整注射量和灌胃量。

1.2.5.2 樣品處理 于實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥后,禁食不禁水12 h,摘取眼球取血,3500 r/min低溫(4 ℃)離心10 min,取血清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠頸椎脫臼處死,摘取肝臟,生理鹽水沖洗干凈,吸干表面水分,取適量肝臟及試劑盒中提取液于研缽中制成10%的組織勻漿,3500 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液備用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 桃膠多糖含量測定

根據(jù)葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:Y=0.0751 X+0.0005(R2=0.9994),代入計(jì)算得到桃膠多糖中所含葡萄糖當(dāng)量為(968.50±8.15) mg/g。

2.2 桃膠多糖體外抗氧化能力評價(jià)

2.2.1 清除DPPH自由基能力 對DPPH自由基清除率變化進(jìn)行曲線繪制(見圖1),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=9.8200X-18.2470(R2=0.9837),IC50為6.95 mg/mL;VC清除率Y=4.8476X+33.6320(R2=0.9911),IC50為3.38 mg/mL。分析結(jié)果可知,在5～10 mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的增大,桃膠多糖對DPPH自由基的清除作用逐漸增強(qiáng);DPPH自由基是很穩(wěn)定的 N-中心自由基,與機(jī)體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān),會損傷相鄰的生物分子造成脂質(zhì)過氧化[22]。因此推測其可能是破壞DPPH自由基中N-中心自由基的穩(wěn)定性而起到清除作用。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖1 桃膠多糖及VC對DPPH自由基清除作用 Fig.1 DPPH free radical-scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

2.2.2 清除ABTS自由基能力 對ABTS自由基清除率變化進(jìn)行曲線繪制(見圖2),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=66.5371X+12.4953(R2=0.9855),IC50為0.56 mg/mL;VC清除率Y=1351.0286X+27.2253(R2=0.9804),IC50為 0.017 mg/mL。分析結(jié)果可知,在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的提高,桃膠多糖對ABTS自由基的清除作用逐漸增強(qiáng);ABTS自由基較穩(wěn)定,主要是其結(jié)構(gòu)中N原子上有個(gè)成單電子,可與苯環(huán)形成p-π共軛,因此推測桃膠多糖能與ABTS自由基的成單電子進(jìn)行配對,破壞p-π共軛體系,從而起到清除作用。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖2 桃膠多糖及VC對ABTS自由基清除作用Fig.2 ABTS free radical scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

2.2.3 清除OH自由基能力 對OH自由基清除率變化進(jìn)行曲線繪制(見圖3),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=29.6571X+17.5067(R2=0.9880),IC50為1.10 mg/mL;VC清除率Y=84.9714X+21.5800(R2=0.9915),IC50為 0.33 mg/mL。分析結(jié)果可知,在0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的提高,桃膠多糖對OH自由基的清除作用逐漸增強(qiáng);表明桃膠多糖能夠清除OH自由基,阻止其降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物,從而保護(hù)細(xì)胞完整性。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖3 桃膠多糖及VC對OH自由基清除作用Fig.3 ·OH scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

圖4 桃膠多糖及VC對自由基清除能力 free radical scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

圖5 桃膠多糖及VC的還原能力Fig.5 Reducing power of peach gum polysaccharide and VC

2.3 總還原能力評價(jià)

分析結(jié)果可知,在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi),桃膠多糖與VC的總還原能力均隨濃度的增大而提高,表明桃膠具備將Fe3+還原成Fe2+形成Fe2+-TPTZ的能力,從而增強(qiáng)系統(tǒng)抗氧化能力。該作用機(jī)理可能為通過自身還原能力給出電子,破壞自由基鏈反應(yīng)的電子供體,從而實(shí)現(xiàn)清除自由基的效果。兩者相比,VC還原能力更強(qiáng)。

2.4 桃膠多糖體內(nèi)抗氧化作用評價(jià)

D-半乳糖衰老模型常用于抗氧化活性的藥效學(xué)評價(jià)。其中,T-AOC水平、SOD與GSH-Px活力是體內(nèi)最重要的抗氧化指標(biāo),可有效清除體內(nèi)自由基;MDA的含量高低能夠代表細(xì)胞膜脂過氧化的程度,間接反映組織抗氧化能力的強(qiáng)弱。

2.4.1 對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響 桃膠多糖對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響具體見表1。分析結(jié)果可知:與空白組相比,模型組小鼠血清中MDA含量顯著提高(P<0.05),T-AOC水平極顯著降低(P<0.01),SOD及GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05),表明D-半乳糖可破壞小鼠的免疫系統(tǒng),加速衰老;與模型組相比,VC陽性組的MDA含量顯著降低(P<0.05),T-AOC水平與SOD活性均極顯著提高(P<0.01),GSH-Px活性顯著提高(P<0.05);與模型組相比,桃膠多糖均可顯著或極顯著降低MDA含量以及提高T-AOC水平、SOD與GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01),且隨著劑量的增加,效果變顯著。表明桃膠多糖對D-半乳糖引起致衰小鼠的SOD、GSH-Px活性具有修復(fù)作用,且提高其總抗氧化能力,可較好改善衰老小鼠的氧化應(yīng)激受損情況;此外,能夠增強(qiáng)小鼠組織的抗氧化能力,減少細(xì)胞膜脂過氧化損傷。

表1 桃膠多糖對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD及GSH-Px活性的影響Table 1 Effects of peach gum polysaccharide on MDA content and activities of T-AOC,SOD and GSH-Px in mouse

2.4.2 對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響 桃膠多糖對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響具體見表2。分析結(jié)果可知:與空白組相比,模型組小鼠肝臟中MDA含量顯著提高(P<0.05)，T-AOC水平、SOD及GSH-Px活性均極顯著降低(P<0.01)， 表明D-半乳糖可成功建立小鼠衰老模型;與模型組相比,VC陽性組的MDA含量顯著降低、T-AOC水平及GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),SOD活性極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,中高劑量的桃膠多糖均可顯著或極顯著降低MDA含量以及提高T-AOC水平、SOD與GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01),且作用強(qiáng)弱與其濃度高低具有一定的正相關(guān)性。表明桃膠多糖能夠緩解D-半乳糖致衰小鼠模型的脂質(zhì)過氧化程度,減少超氧陰離子等自由基在小鼠體內(nèi)的積累,起到保護(hù)機(jī)體細(xì)胞、修復(fù)機(jī)體損傷的作用。

表2 桃膠多糖對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD及GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of peach gum polysaccharide on MDA content and activities of T-AOC,SOD and GSH-Px in mouse

3 討論與結(jié)論