基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析越鞠丸治療抑郁癥的分子機(jī)制

朱文婷，趙瑞珍，程翰林，呂亞紅，孫銘浚

0 引言

抑郁癥是一種常見的由多種原因引起的精神障礙疾病，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重者有高度自殘、自殺傾向[1-3]。抑郁癥屬中醫(yī)情志病范疇，根據(jù)其發(fā)病出現(xiàn)情緒低落、明顯焦慮、悲痛、木僵甚至出現(xiàn)幻覺、妄想等臨床特點歸于中醫(yī)“郁證”[4-6]。中醫(yī)治療“郁證”多應(yīng)用調(diào)氣之方藥，其中越鞠丸為治療郁證的代表。越鞠丸能夠有效提高抑郁患者血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factors,BDNF)水平及抑郁癥小鼠相關(guān)腦區(qū)海馬腺苷酸環(huán)化酶激活肽的表達(dá),同時激活PACAP下游PKA-CREB信號通路,起到抗抑郁作用[7-9]。為進(jìn)一步研究越鞠丸治療抑郁的機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)新的作用靶點，本研究基于生物信息技術(shù)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對越鞠丸中香附、川芎、蒼術(shù)、神曲、梔子5味中藥的有效化學(xué)成分進(jìn)行篩選，找出其治療抑郁癥的有效靶點基因及信號通路。

1 資料與方法

1.1 篩選越鞠丸中的化學(xué)成分 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，網(wǎng)址http://lsp.nwu.edu.cn /index.php)檢索越鞠丸中5味中藥的有效成分。篩選標(biāo)準(zhǔn)：香附、川芎、蒼術(shù)、神曲、梔子的中藥化合物的藥物動力學(xué)口服生物利用度(OB)≥30%,藥物相似性(DL)≥0.18。

1.2 篩選越鞠丸與抑郁癥的共同作用靶點 應(yīng)用uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)、Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)，將越鞠丸5味中藥的關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點信息和抑郁癥的靶點基因進(jìn)行相互映射，最終得到藥物-疾病靶點基因及與之對應(yīng)的關(guān)鍵化學(xué)成分。

1.3 關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)可視化 應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件將篩選出的越鞠丸中5味中藥的關(guān)鍵化學(xué)成分與抑郁癥的共同靶點基因進(jìn)行可視化處理。其中節(jié)點代表關(guān)鍵化合物和靶點，邊線代表各個節(jié)點的相互作用關(guān)系。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network，PPI)的構(gòu)建 應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/Version 10.5)將越鞠丸與抑郁癥的共同靶點基因輸入，研究對象選取人類(Homo sapiens)，可得到越鞠丸與抑郁癥蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。將蛋白相互關(guān)系的評分設(shè)為0.9，然后隱藏圖中的游離蛋白，其中網(wǎng)絡(luò)圖中基因共進(jìn)化證據(jù)以藍(lán)色表示，基因融合證據(jù)以紅色表示，文本挖掘證據(jù)以黃色表示。研究主要選取排名前15位的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 GO(Gene ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析 應(yīng)用Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)查詢越鞠丸各中藥-抑郁癥的共同靶點基因的基因ID。安裝Bioconductor平臺相關(guān)文件，將pvalue與qvalue均設(shè)置為0.05，分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。所得結(jié)果以barplot柱狀圖表示，應(yīng)用Cytoscape軟件繪制越鞠丸治療抑郁癥的靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 越鞠丸化學(xué)成分的篩選 越鞠丸化學(xué)篩選過程中未獲得神曲相關(guān)信息，最終得到49個化學(xué)成分，蒼術(shù)9個、香附18個、川芎7個、梔子15個，見表1。

2.2 藥物-疾病靶點預(yù)測 本研究中評分≥5的相關(guān)疾病靶點基因共1 594個，將藥物與疾病的靶點基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病共同靶點基因共90個。記錄共同靶點所對應(yīng)的越鞠丸有效化合物，最終得到越鞠丸扶正解毒合劑和抑郁癥的關(guān)鍵化學(xué)成分共26個，共同基因靶點共90個。

2.3 藥物關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究排名前5位的關(guān)鍵化合物為槲皮素(Quercetin，MOL000098，degree=62)、山萘酚(Kaempferol，MOL000422，degree=24)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol，MOL000358，degree=19)、木犀草素(Luteolin，MOL000006、degree=17)、四氫巴馬汀(Hyndarin，MOL004071、degree=15)。排名前10位的靶點為PTGS2、HSP90AA1、DPP4、GABRA1、AR、GSK3B、PPARG、SCN5A、MAPK14、ADRB2。見圖1(靶點以矩陣表示，化合物以圓圈表示，不同藥物的化合物以不同顏色表示，“degree”代表藥物活性成分)。

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 本研究中PPI網(wǎng)絡(luò)包括90個節(jié)點，221條邊，其中評分≥0.995的互作蛋白為CASP8-CASP3、AKT1-GSK3B、AKT1-NOS3、AKT1-HSP90AA1、IL1B-IL1A、IGF2-IGFBP3、IL6-IL4、BCL2-CASP8。根據(jù)每個基因連接節(jié)點的數(shù)目排名，最終得到排名前15位的PPI核心基因，分別為MAPK1、AKT1、HSP90AA1、IL6、FOS、MAPK14、MAPK8、ESR1、NR3C1、STAT1、VEGFA、EGF、IL1B、AR、IL2，它們?yōu)樵骄贤柚委熞钟舭Y的核心基因。見圖2、圖3。

2.5 GO功能富集分析 富集生物過程(Biological process，BP)結(jié)果顯示，主要包括脂多糖應(yīng)答(Response to lipopolysaccharide)、細(xì)菌起源分子應(yīng)答(Response to molecule of bacterial origin)、金屬離子應(yīng)答(Response to metal ion)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平(Regulation of neurotransmitter levels)、營養(yǎng)水平應(yīng)答(Response to nutrient levels)。見圖4。

表1 越鞠丸的有效化學(xué)成分

圖1 越鞠丸關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI核心基因

富集細(xì)胞組成(Cellular component，CC)結(jié)果顯示，主要包括膜筏(Membrane raft)、膜微區(qū)(Membrane microdomain)、膜區(qū)(Membrane region)等，見圖5。富集分子功能(Molecular function，MF)結(jié)果顯示，主要包括兒茶酚胺結(jié)合(Catecholamine binding)、銨離子結(jié)合(Ammonium ion binding)、類固醇激素受體活性(Steroid hormone receptor activity)等。見圖6。

2.6 KEGG通路富集分析 AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等是關(guān)鍵靶點蛋白主要富集的通路。見圖7。

2.7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件將得到的通路和靶點信息繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)連接節(jié)點數(shù)目設(shè)定degree，其中圖片的形狀越大說明靶點富集越顯著，篩選出的核心靶點分別為MAPK10、MAPK8、AKT1、MAPK1、MAPK14、FOS、IL6、CASP8、CASP3等。見圖8。

圖4 越鞠丸主要作用靶點BP條形圖

圖5 越鞠丸主要作用靶點CC條形圖

圖6 越鞠丸主要作用靶點MF條形圖

圖7 越鞠丸主要作用靶點KEGG富集分析條形圖

圖8 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

越鞠丸為治療“郁病”之經(jīng)典方藥，越鞠丸中蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子5味中藥配伍具有行氣解郁之功效。其中香附重在行氣解郁，治療氣郁證；川芎重在活血行氣，治療血郁證；蒼術(shù)重在燥濕健脾，治療濕郁證；梔子重在清熱除煩，治療火郁證；神曲重在消食和中，治療食郁證。抑郁癥病因復(fù)雜，越鞠丸則針對不同病因應(yīng)用不同藥物以對癥治療[10-12]。關(guān)于越鞠丸治療抑郁癥的研究較多，但單純地研究單一蛋白、通路缺乏系統(tǒng)性和科學(xué)性，對分子機(jī)制的闡述存在局限。根據(jù)生物信息技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)概念與學(xué)說，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠?qū)υ骄贤柚委熞钟舭Y的多成分、多層次、多靶點、多通路的系統(tǒng)模型進(jìn)行詳細(xì)展示，對未來進(jìn)行臨床、實驗研究提供可靠依據(jù)和方向。

本研究中，越鞠丸所含的槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、木犀草素、四氫巴馬汀等在對靶點基因的匹配中，具有較高的自由度。槲皮素常見于川芎中，是一種黃酮類化合物，能夠降低體內(nèi)的鐵過載，減少其導(dǎo)致的氧化損傷，同時對創(chuàng)傷后神經(jīng)損傷引起的運動和感覺損傷具有較強(qiáng)的修復(fù)作用，此外，槲皮素具有抗炎、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用，對機(jī)體的神經(jīng)和血管具有保護(hù)作用[13]；山萘酚屬黃酮醇類化合物，具有多種生物學(xué)作用，并具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用，山萘酚可通過清除自由基、調(diào)節(jié)NO水平、增強(qiáng)抗氧化酶活性、抑制低密度脂蛋白氧化損傷等途徑實現(xiàn)抗氧化機(jī)制，且能夠影響NF-κB信號通路，使神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷[14]；β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，廣泛存在于自然界中，其分子結(jié)構(gòu)與膽固醇類似，具有降膽固醇作用，同時具有解熱抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，對免疫系統(tǒng)具有增強(qiáng)作用；木犀草素是天然黃酮類化合物，與炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生密切相關(guān)，且與NF-κB介導(dǎo)的基因表達(dá)有關(guān)，能夠通過抑制HMGB1起到腦保護(hù)作用[15-16]；四氫巴馬汀是一種生物堿，具有鎮(zhèn)靜催眠作用，臨床多用于失眠的治療，同時，其對大腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用，能夠通過抑制鈣離子聚集而顯著減少神經(jīng)元凋亡。

本研究中的關(guān)鍵靶點蛋白有MAPK10、MAPK8、AKT1、MAPK1、MAPK14、FOS、IL6、CASP8、CASP3等。絲裂原活化的蛋白激酶家族(MAPK)參與各種過程，如神經(jīng)元增殖、分化、遷移和程序性細(xì)胞死亡，參與促炎性細(xì)胞因子或身體應(yīng)激之類的細(xì)胞外刺激應(yīng)激激活的SAP/JNK信號傳導(dǎo)途徑[17-19]；AKT1是AKT激酶的3種緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2、AKT3)之一，調(diào)節(jié)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成，其可通過一系列下游底物的絲氨酸和/或蘇氨酸磷酸化介導(dǎo)上述生物過程；原癌基因c(Fos)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化中起著重要作用；IL-6是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，它是急性期反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，在B細(xì)胞最終分化為Ig分泌細(xì)胞中起著重要作用，參與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化，作用于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。CASP8激活級聯(lián)的大多數(shù)上游蛋白酶負(fù)責(zé)TNFRSF6/FAS介導(dǎo)和TNFRSF1A誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；CASP3參與負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的胱天蛋白酶的激活級聯(lián)反應(yīng)，通過RET裂解觸發(fā)交感神經(jīng)元中的細(xì)胞黏附。

GO富集分析結(jié)果顯示，富集的生物過程主要包括脂多糖應(yīng)答、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、營養(yǎng)水平應(yīng)答等。KEGG富集分析所涉及的通路包括AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。RAGE是在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促炎性介質(zhì)的作用，AGEs是RAGE的重要配體,能夠直接或間接介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生，損傷神經(jīng)[20]；IL-17介導(dǎo)的炎癥信號通路與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[21]；TNF信號通路對促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥均發(fā)揮了較強(qiáng)的效應(yīng)[22]。

本研究通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對越鞠丸治療抑郁癥過程中的關(guān)鍵化學(xué)成分、作用靶點及信號通路進(jìn)行了分析，探討越鞠丸治療抑郁癥多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜作用機(jī)制，證明越鞠丸可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)保護(hù)實現(xiàn)抗抑郁的作用。