臭茉莉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及月周期變化研究

喻錄容，宋小云，何先元，，黃 鶴，歐陽凱，黃英如

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

臭茉莉來源為馬鞭草科大青屬植物臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.以根、葉入藥，全年可采，切制，曬干或者鮮用，性平，味苦，有祛風(fēng)利濕、化痰止咳、活血消腫的功效。根可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腳氣水腫、白帶、支氣管炎等，葉多外用治療濕疹、皮膚搔癢等。全草中含有黃酮苷、酚類、皂苷、鞣質(zhì)、黃酮類化合物［1-2］。黃酮類廣泛存在于植物界，具有抗炎癥、抗過敏、抑制細(xì)菌真菌病毒繁殖和寄生蟲生長、防治肝病及心腦血管疾病、抗腫瘤等作用。我們對臭茉莉葉總黃酮提取工藝，1年內(nèi)月周期變化規(guī)律［3-9］進(jìn)行了研究，以期為臭茉莉最佳采收期提供經(jīng)濟(jì)效益的理論參考。

1 材 料

儀器。UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），TG328B型分析天平（上海精科天平儀器廠），藥典篩（浙江上虞市五四儀器廠），SB-5200DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份公司，200W），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪華中儀器廠），RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生化儀器廠）。

試藥。藥材采自重慶市重慶醫(yī)科大學(xué)植物園（經(jīng)生藥學(xué)費(fèi)曜副教授鑒定為臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.），3月15日采集的主要是頂芽，4～10月每月的15日采集頂芽后3～6位葉，去除雜質(zhì)，立即烘箱60℃烘干，打成粉末過4號藥典篩備用，以下粉末均同一處理方式。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%，批號130507，北京德威鈉生物技術(shù)有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和無水乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法建立

對照品溶液：精密稱取105 ℃下烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0200 g，置50mL量瓶中，加70 %的乙醇溶液，超聲處理（功率：200W，頻率：20kHz），振搖溶解，然后配成濃度為4.0mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液M和0.4mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液N。

實(shí)驗(yàn)樣品溶液：精密稱取每個月份（3、4、5、6、7、8、9、10月份）的臭茉莉葉粉末（過4號藥典篩）1g左右分別于50mL錐形瓶，每個錐形瓶均精密加入20mL的70%乙醇，在60℃條件下超聲（200W，40kHz）30min，提取2次，抽濾，合并濾液，恒溫水浴下蒸干，殘存物用70%乙醇溶解，然后至50mL容量瓶定容，即一年內(nèi)8個月份臭茉莉葉實(shí)驗(yàn)樣品溶液。

溶液的顯色：精密移取8個月份的臭茉莉葉實(shí)驗(yàn)樣品溶液各1.0 mL，均加入5 %亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振搖均勻，靜置6min后，加入10 %硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻后再靜置6min，接著加入4%氫氧化鈉溶液5mL，靜置15min后，即為8個月份實(shí)驗(yàn)樣品溶液顯色結(jié)果。

檢測波長的確定：精密量取實(shí)驗(yàn)樣品溶液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液N各1mL，以70%乙醇溶液為空白對照組，顯色后在400～700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，兩者共有的最大吸收波長即為檢測波長。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和臭茉莉葉實(shí)驗(yàn)樣品溶液在508nm處均為最大吸收波長，故確定508nm為實(shí)驗(yàn)檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品B 0.0，0.1，0.2，0.5，1.0mL，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液M0.2，0.4mL，分別置于15mL具塞試管中，靜置6min，用0mL試管做空白對照組，用紫外分光光度計(jì)，選擇在508nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)（mg·mL-1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程：A=1.7983C-0.02129（r=0.99934），結(jié)果表明，蘆丁對照品質(zhì)量濃度在0.04～1.60mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 臭茉莉葉總黃酮提取率的計(jì)算

精密吸取臭茉莉葉實(shí)驗(yàn)樣品溶液1.0mL，顯色完成后，即刻測定其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程計(jì)算出實(shí)驗(yàn)樣品溶液中總黃酮含量，以便計(jì)算出臭茉莉葉中總黃酮的提取率。

總黃酮提取率=實(shí)驗(yàn)樣品液中總黃酮含量/臭茉莉葉質(zhì)量×100%。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇濃度對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定料液比為1∶20（g·mL-1），溫度為30℃，然后選擇不同的乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%等條件下提取3次，每次30min，比較總黃酮含量，預(yù)測正交試驗(yàn)將要采用乙醇提取濃度范圍。結(jié)果隨著乙醇濃度增加后，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，在乙醇濃度為60%時，總黃酮提取率達(dá)到最高。見圖1-A。

超聲時間對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·mL-1，溫度為30℃，選擇不同的超聲時間為25min、30min、35min、40min、45min等條件下提取3次，比較總黃酮含量，預(yù)測正交試驗(yàn)將采用的超聲時間范圍。結(jié)果顯示隨著超聲提取時間的延長，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其中在超聲提取時間為50 min時，總黃酮提取率達(dá)到最高。見圖1-B。

料液比對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70 %乙醇為提取溶劑，溫度為30 ℃，時間為每次30min，選擇不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g·mL-1）等條件下提取3次，測定比較總黃酮含量，預(yù)測正交試驗(yàn)將要采用的料液比范圍。結(jié)果顯示隨著料液比提高，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其中在料液比為1∶25（g·mL-1）時，臭茉莉葉總黃酮提取率達(dá)到最高。見圖1-C。

提取溫度對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·mL-1，時間為30min，在不同的提取溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等條件下分別提取3次，測定比較總黃酮含量，預(yù)測正交試驗(yàn)將采用的提取溫度范圍。結(jié)果顯示隨著溫度增高，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在溫度為50 ℃時臭茉莉葉總黃酮提取率最高。見圖1-D。

圖1 乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）及提取溫度（D）對臭茉莉總黃酮提取的影響

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選臭茉莉葉總黃酮提取最優(yōu)工藝

綜合前面單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）對臭茉莉葉總黃酮提取率的影響，正交試驗(yàn)因素與水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，對臭茉莉葉總黃酮提取率的影響，由大到小排列依次是乙醇濃度＞料液比＞超聲時間＞提取溫度?？傸S酮最佳提取工藝組合是A2B3C2D2，即乙醇濃度為60%，超聲提取時間為60min，料液比為1∶25（g·mL-1），提取溫度為50℃，按這個工藝提取的臭茉莉葉總黃酮含量最高。

2.6 臭茉莉葉總黃酮最優(yōu)提取工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱定臭茉莉葉粉末1.0000g，按照最優(yōu)提取工藝流程進(jìn)行操作提取，顯色完成后，立即測定溶液吸光度，然后，每間隔30min測一次溶液吸光度，考察4h內(nèi)總黃酮的穩(wěn)定性。結(jié)果臭茉莉葉總黃酮吸光度結(jié)果的RSD（n=9）值為0.95%，說明在4h內(nèi)，黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和臭茉莉葉總黃酮采用本文的提取方法和顯色方法都比較穩(wěn)定。

2.7 臭茉莉葉總黃酮最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取臭茉莉葉粉末10.0000g，3份，按照最優(yōu)提取工藝進(jìn)行提取操作，顯色完成后，立即測定溶液吸光度，計(jì)算臭茉莉葉總黃酮平均提取率和含量。結(jié)果臭茉莉葉總黃酮平均提取率為5.18%，RSD=2.17%（n=3）。臭茉莉葉總黃酮含量為5.18mg·g-1。與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明最優(yōu)工藝合理可行。

2.8 臭茉莉葉總黃酮最優(yōu)提取精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取蘆丁對照品溶液1 mL，置于15 mL具塞試管中，按“2.1”方法顯色并制備空白溶液后在508nm波長處測定吸光度，平行操作5次。結(jié)果，RSD＝0.27%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.9 臭茉莉葉3-10月份總黃酮含量測定結(jié)果

采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最優(yōu)工藝條件，提取測定臭茉莉3～10等8個月份總黃酮，從圖E可以看出，臭茉莉總黃酮代謝變化呈現(xiàn)出“高-低-高-低-高-低”的趨勢。3月份總黃酮含量最高，總黃酮/藥材量達(dá)0.0235mg·g-1，也就是臭茉莉剛剛長出嫩芽時就總黃酮含量最高；其次是5月的0.0194 mg·g-1和7月的0.0182 mg·g-1，3月份總黃酮含量最高，出現(xiàn)這種情況的可能原因是經(jīng)歷了一個冬天的休眠，春季剛開始進(jìn)行旺盛的生命活動，代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了黃酮，盡管總黃酮含量最高，但剛發(fā)的芽葉片比較小，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量還是比較低；5月份和7月份總黃酮含量比較高，此時枝繁葉茂，葉片經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量比較高，適合采收；到了8～10月，植物葉片產(chǎn)量增加不大，黃酮含量減少，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量比較低，經(jīng)濟(jì)效益就低。黃酮屬于植物新陳代謝的次生產(chǎn)物，總黃酮含量變化符合植物生長大周期規(guī)律。

圖E 臭茉莉葉3-10月份總黃酮含量變化趨勢

3 討 論

提取工藝簡單可行。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出提取總黃酮的最優(yōu)工藝，即乙醇濃度為70%，超聲時間為60min，料液比為1∶25（g·mL-1），提取溫度為50℃，提高臭茉莉葉總黃酮提取率。4個因素對臭茉莉葉總黃酮提取率影響的大小一次是提取溶劑濃度＞料液比＞超聲時間＞提取溫度，因此提取過程中一定要嚴(yán)格把控提取溶劑濃度，它對總黃酮的提取率有顯著影響，在一定范圍內(nèi)，臭茉莉葉總黃酮提取率會隨著溶劑濃度升高而增大。

總黃酮含量呈周期變化。臭茉莉葉總黃酮一年內(nèi)月周期變化基本符合植物葉片生長大周期規(guī)律，與植物生長代謝基本一致，當(dāng)葉片生長快時，總黃酮含量低；當(dāng)葉片生長慢時，總黃酮含量高；植物葉片不生長時，總黃酮含量下降［10］。

經(jīng)濟(jì)效益使用價值最高時采收。從總黃酮含量，盡管3月份含量最高，但是葉片產(chǎn)量最低，總黃酮使用價值僅從體外抗氧化活性分析［11］，臭茉莉葉總黃酮對DPPH自由基清除率6月份達(dá)最高，總黃酮對ABTS自由基的清除能力5月份和7月份出現(xiàn)兩個峰值，所以，結(jié)合葉片產(chǎn)量、總黃酮含量和體外抗氧化效應(yīng)等綜合因素來考慮，5月份和7月份作為采收最佳時節(jié)。