姚 益,曾小飛,李 衛(wèi),姚中山,賈維坤
肺癌是發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤,其中85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1]。大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)腫瘤已發(fā)展為中晚期[2],5年生存率僅為19.7%,其術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是兩個(gè)最具挑戰(zhàn)性的障礙[3]。然而,腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖是多種抑癌基因及癌基因共同參與的病理過程[4]。本實(shí)驗(yàn)分析NSCLC中G蛋白偶聯(lián)受體120(G-protein coupled receptor 120, GPR120)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factorm, VEGF)的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系,旨在尋找預(yù)測(cè)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物,初步探討NSCLC的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制,有助于提前選擇肺癌患者的綜合治療策略和進(jìn)一步改善NSCLC患者的生存率。
1.1 臨床資料(1)收集2017年6月~2019年10月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸心外科行肺癌根治術(shù)的42例新鮮肺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁肺組織(距離腫瘤邊緣>2 cm),均經(jīng)病理學(xué)明確診斷。(2)另收集病理科2017年1月~2019年6月存檔的85例NSCLC石蠟切塊及62例對(duì)應(yīng)癌旁正常肺組織。85例NSCLC中男性57例,女性28例;年齡36~79歲,平均61.9歲;腫瘤直徑≥5 cm者30例,腫瘤直徑<5 cm者55例;其中腺癌48例,鱗癌26例,其他類型11例;中+高分化56例,低+未分化29例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者32例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14例;TNM分期:Ⅰ期35例,Ⅱ期15例,Ⅲ期21例,Ⅳ期14例。隨訪采用查閱患者復(fù)查資料結(jié)合電話方式進(jìn)行,隨訪時(shí)間6~36個(gè)月,隨訪截止時(shí)間2019年12月31日,失訪者隨訪時(shí)間按截尾數(shù)據(jù)處理。
1.2 主要試劑總RNA提取試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自索萊寶生物公司;Anti-GPCR GPR120抗體(ab230869)購自美國Abcam Biochemicals公司;Anti-VEGF購自武漢三鷹生物公司。
1.3 方法
1.3.1qPCR 對(duì)42例新鮮NSCLC腫瘤組織和癌旁組織樣本進(jìn)行qPCR分析。進(jìn)行總RNA提取并進(jìn)一步行qPCR分析,比較配對(duì)的兩組間差異;同時(shí)繪制散點(diǎn)圖,分析GPR120與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性。GPR120正向引物5′-TTGAACTTCTTGGT GCCAGGACTG-3′,反向引物5′-CCGTGAGCCTCTTC CTTGATGC-3′。VEGF正向引物5′-TGCAATGGAT CAAGGACCAGAGG-3′,反向引物5′-TGCAGCCAG CAAGAAGCATCAG-3′。標(biāo)準(zhǔn)化基準(zhǔn)物為β-actin,其正向引物5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′,反向引物5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。
1.3.2免疫組化 采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè),一抗GPR120、VEGF的稀釋濃度為1∶100。免疫組化結(jié)果判定:按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:無陽性著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分:陽性細(xì)胞0~20%為1分,21%~50%為2分,51%~100%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘作為最終得分:<4分為低表達(dá)或不表達(dá),而≥4分為高表達(dá)。
1.3.3Western blot檢測(cè) 分別將收集的NSCLC與癌旁組織樣本進(jìn)行充分裂解,并采用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測(cè)定,將蛋白樣本進(jìn)行等量上樣,上樣量為10 μL,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,以脫脂奶粉封閉1 h。而后加入一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,洗滌后加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h,洗滌后顯色、定影,使用凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)觀察。并對(duì)GPR120、VEGF蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行分析比較。
2.1 NSCLC新鮮標(biāo)本中GPR120、VEGF的表達(dá)對(duì)42例新鮮NSCLC腫瘤組織和癌旁組織行qPCR及Western blot檢測(cè)GPR120、VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,NSCLC中GPR120 mRNA在癌組織中和對(duì)應(yīng)癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量分別為1.82±0.58和1.32±0.58(t=5.219,P<0.001);VEGF mRNA在癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.73±0.43和0.95±0.35(t=8.900,P<0.000 1,圖1)。NSCLC腫瘤組織GPR120蛋白條帶的灰度比值(1.41±0.55)比對(duì)應(yīng)癌旁組織(1.00±0.28)高(t=4.492,P<0.001);VEGF蛋白條帶的灰度比值(1.58±0.76)比對(duì)應(yīng)癌旁組織(1.01±0.23)高(t=4.990,P<0.001),且GPR120、VEGF蛋白表達(dá)量隨著腫瘤TNM分期越晚表達(dá)具有上升趨勢(shì)(圖2)。NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P<0.001)。通過散點(diǎn)圖分析GPR120與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果顯示,NSCLC癌組織中GPR120、VEGF mRNA表達(dá)量呈正性線性相關(guān)(r=0.738 6,P<0.000 1),即隨著NSCLC癌組織中GPR120表達(dá)量增加,VEGF mRNA表達(dá)量亦隨之增高(圖3);癌旁正常肺組織中GPR120、VEGF mRNA表達(dá)量呈負(fù)性線性相關(guān),即NSCLC癌旁正常組織中GPR120、VEGF mRNA表達(dá)無特定規(guī)律可循(r=-0.0743 0,P=0.640 0,圖3)。
2.2 NSCLC石蠟組織中GPR120、VEGF的表達(dá)免疫組化顯示GPR120、VEGF在NSCLC及其對(duì)應(yīng)正常組織中均定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)(圖4、5)。85例NSCLC石蠟樣本中有50例(58.82%)觀察到GPR120高表達(dá),52例(61.18%)VEGF高表達(dá),而在與之匹配的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期共62例腫瘤鄰近組織樣本中有14例GPR120高表達(dá)(22.58%),10例(16.13%)VEGF高表達(dá)。NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)。
2.3 GPR120、VEGF表達(dá)的相關(guān)性及與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系在85例NSCLC組織中,GPR120、VEGF共同高表達(dá)39例,共同低表達(dá)22例。采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果表明GPR120與VEGF表達(dá)呈顯著強(qiáng)相關(guān)(r=0.413,P<0.001)。NSCLC中GPR120蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05);VEGF蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05,表1)。
2.4 GPR120、VEGF表達(dá)與NSCLC患者生存期的關(guān)系85例NSCLC患者隨訪時(shí)間3~36個(gè)月,中位隨訪時(shí)間27個(gè)月。分別建立Kaplan-Meier生存模型曲線,采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析:GPR120、VEGF蛋白高表達(dá)患者比低表達(dá)患者預(yù)后水平差,累積存活時(shí)間低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GPR120、VEGF同時(shí)高表達(dá)患者與兩者同時(shí)低表達(dá)及GPR120或VEGF僅有一種高表達(dá)患者相比預(yù)后水平差,累積存活時(shí)間相對(duì)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。
2.5 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,仍以本組85例NSCLC為樣本,以預(yù)后狀況為應(yīng)變量,賦值0=生存,1=死亡。Cox回歸模型多變量分析發(fā)現(xiàn),85例NSCLC患者的總生存率與多種因素相關(guān),其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.007)、GPR120蛋白高表達(dá)(P=0.027)為NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(表2)。
圖1 NSCLC癌組織及癌旁正常組織中GPR120(A)、VEGF(B)mRNA的表達(dá)
圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中GPR120(A)、VEGF(B)蛋白的表達(dá):N.癌旁正常組織;Ca.癌組織
圖3 A.NSCLC癌組織中GPR120與VEGF mRNA表達(dá)散點(diǎn)圖;B.癌旁正常肺組織中GPR120與VEGF mRNA表達(dá)散點(diǎn)圖
表1 NSCLC中GPR120、VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
④A④B④C⑤A⑤B⑤C
圖6 A.GPR120表達(dá)和NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系;B.VEGF表達(dá)和NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系;C.GPR120、VEGF不同表達(dá)狀態(tài)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系
肺癌患者的5年生存率低,其中一項(xiàng)重要原因是患者就診時(shí)腫瘤已為中晚期,表現(xiàn)出明顯的侵襲轉(zhuǎn)移特征[3]。然而,腫瘤的侵襲遷移、增殖的產(chǎn)生是多種抑癌基因及癌基因共同參與的病理過程[4]。新近發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族重要成員GPR120與部分惡性腫瘤關(guān)系密切,然而其作用及參與機(jī)制尚不清楚,可在不同腫瘤中或即使同一腫瘤的不同細(xì)胞系表現(xiàn)出相反的作用,且在肺癌中的研究較少[5-8]。VEGF在腫瘤中的作用研究一直為一個(gè)熱門方向,其檢測(cè)在NSCLC的診斷、治療、預(yù)后評(píng)估等方面具有重要價(jià)值[9-11]。目前以VEGF為靶點(diǎn)治療NSCLC的抗血管生成藥物貝伐珠單抗在我國獲批用于臨床治療晚期NSCLC。前期Wu等[5,12]對(duì)人類結(jié)直腸癌及食管癌研究中發(fā)現(xiàn)GPR120與VEGF表達(dá)密切相關(guān)。因此,探究GPR120、VEGF在NSCLC中的作用及關(guān)系對(duì)NSCLC的評(píng)估及治療具有一定意義。
表2 影響NSCLC患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)采用qPCR、Western blot、免疫組化檢測(cè)均發(fā)現(xiàn),NSCLC腫瘤組織中GPR120、VEGF表達(dá)高于對(duì)應(yīng)癌旁肺組織,且隨著腫瘤分期越晚表達(dá)越高。分析GPR120蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系表明:GPR120蛋白高表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚之間關(guān)系密切。上述結(jié)果提示,GPR120高表達(dá)NSCLC患者可能會(huì)有更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的臨床分期。這也與結(jié)直腸癌[5]、食管癌[12]、乳腺癌[13]等癌組織中的研究結(jié)果相同。Wu等[5,12]研究表明在人類結(jié)直腸癌組織及食管癌中GPR120表達(dá)與腫瘤病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性。郭文靜[13]亦發(fā)現(xiàn),GPR120蛋白在乳腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常組織,且與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn),NSCLC中VEGF蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān),這與Lin等[10-11]的研究結(jié)果一致。此研究還表明GPR120與VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著相關(guān),兩者之間可能具有共同作用。這些結(jié)果說明GPR120在NSCLC中高表達(dá)的同時(shí)伴隨著VEGF高表達(dá)。Wu等[5,12]在結(jié)直腸癌、食管癌中研究結(jié)果可能解釋其原因,其研究顯示GPR120上調(diào)可通過PI3K/Akt-NF-κB通路上調(diào)VEGF促進(jìn)結(jié)直腸癌及食管癌血管生成,并參與腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。因此,我們推測(cè)在NSCLC中GPR120高表達(dá)可使VEGF表達(dá)亦上調(diào),GPR120高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期之間相關(guān)可能是VEGF上調(diào)的結(jié)果??傊?,GPR120、VEGF高表達(dá)可使NSCLC患者腫瘤細(xì)胞生長、遷移侵襲能力增強(qiáng),可以向更深、更遠(yuǎn)處浸潤轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)GPR120、VEGF蛋白表達(dá)與患者生存期密切相關(guān),經(jīng)Cox多因素回歸分析也應(yīng)證了這一點(diǎn),同樣也應(yīng)證了GPR120與VEGF的共同作用促進(jìn)了NSCLC的惡性進(jìn)展,不利于NSCLC的預(yù)后。與Lin等[10]報(bào)道VEGF高表達(dá)預(yù)示不良的預(yù)后,具有更短的生存期一致。上述結(jié)果說明GPR120、VEGF表達(dá)可促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展,并影響NSCLC患者的生存期,可以作為判斷NSCLC預(yù)后的指標(biāo)之一。
然而本組檢測(cè)GPR120在臨床標(biāo)本上的表達(dá)與Kita等[8]研究肺癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)的GPR120可能抑制肺癌A549細(xì)胞的惡性特征結(jié)果相反,分析其可能原因:(1)GPR120涉及的分子機(jī)制不同,GPR120在同種腫瘤中涉及到的機(jī)制不同可能表現(xiàn)出相反作用[5-6];(2)GPR40的干擾,正如Kita等[8]研究的結(jié)果一樣,GPR120與GPR40在肺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)出相反的作用,共同調(diào)節(jié)肺癌的細(xì)胞功能。在其他腫瘤中研究結(jié)果亦同樣存在該現(xiàn)象[14];(3)腫瘤組織中間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞對(duì)檢測(cè)具有一定干擾。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GPR120與VEGF均在NSCLC中表達(dá)上調(diào),且顯示出共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用,但其涉及的分子機(jī)制還不明確,后期還需進(jìn)一步明確GPR120與VEGF之間的作用分子機(jī)制及調(diào)控關(guān)系,為進(jìn)一步研究GPR120在NSCLC中的具體作用奠定基礎(chǔ)。此外,GPR120及VEGF高表達(dá)提示NSCLC患者預(yù)后相對(duì)較差,Cox分析也進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GPR120可能通過VEGF發(fā)揮促癌作用,有望作為新的評(píng)估、治療NSCLC的靶點(diǎn)。