結(jié)直腸腺癌中MMP-2和TIMP-4的表達(dá)及其意義

曹子川，吳正升，吳文涌

結(jié)直腸腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2018年美國癌癥學(xué)會發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率居于惡性腫瘤第3位，病死率居第2位[1-2]。近年我國結(jié)直腸腺癌的發(fā)病率總體呈上升趨勢，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期[3-4]。因此，探討結(jié)直腸腺癌早期診斷的標(biāo)志物以及其發(fā)生、發(fā)展的具體機制，改善患者的預(yù)后至關(guān)重要?，F(xiàn)研究認(rèn)為腫瘤發(fā)展與腫瘤細(xì)胞間質(zhì)降解密切相關(guān)，MMP-2主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠和彈性纖維，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；并且在腫瘤發(fā)生、生長、血管生成及轉(zhuǎn)移等多個階段均發(fā)揮重要作用[5]。TIMP-4屬于蛋白類抑制劑，同時還在細(xì)胞生長、增殖及刺激血管生成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝等方面發(fā)揮作用?，F(xiàn)階段TIMP-4在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及其與MMP-2的關(guān)系尚不明了。本實驗采用qRT-PCR、Western blot以及免疫組化法檢測MMP-2和TIMP-4在結(jié)直腸腺癌及正常腸組織中的表達(dá)情況，并分析MMP-2和TIMP-4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科2019年3～6月結(jié)直腸腺癌術(shù)中新鮮標(biāo)本及其對應(yīng)正常腸組織(距癌組織邊緣2 cm以上)各20例，組織置于液氮中凍存?zhèn)溆?。同時收集2012年1～12月病理科存檔的結(jié)直腸腺癌石蠟標(biāo)本90例，正常腸組織(距癌組織邊緣2 cm以上)石蠟標(biāo)本50例，高級別上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)和低級別上皮內(nèi)瘤變(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)石蠟標(biāo)本各30例。切成4 μm厚連續(xù)切片做免疫組化染色。免疫組化結(jié)果由2名病理科醫(yī)師采用雙盲原則進(jìn)行評判。所有患者術(shù)前均未接受放、化療等。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人MMP-2多克隆抗體(1∶100)、鼠抗人TIMP-4多克隆抗體(1∶150)購自武漢三鷹Proteintech公司；通用型試劑盒PV 6000、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑以及qRT-PCR試劑均購自北京全式金生物公司。

1.3 方法

1.3.1RNA提取和qRT-PCR檢測 從新鮮組織樣本中提取RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書制備所需的cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參。qRT-PCR引物序列：TIMP-4上游5′-CTGCGGCTGCTGGCGTTG-3′，下游5′-ATACTGCTTCTGGCTGTTGGCTTC-3′；MMP-2上游5′-CGACCACAGCCAACTACGATGATG-3′，下游5′-GTGCCAAGGTCAATGTCAGGAGAG-3′；GAPDH上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.3.2蛋白提取和Western blot檢測 使用蛋白裂解液裂解提取新鮮組織蛋白，使用10%SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min后置于5%脫脂牛奶中封閉1 h；一抗4 ℃孵育過夜，使用PBST洗膜3次；室溫二抗孵育1 h，使用PBST洗膜3次，漂洗結(jié)束后加入顯影液避光顯影。

1.3.3免疫組化 采用EnVision法進(jìn)行免疫組化染色。首先將待染色的切片放置于烤箱65 ℃烘烤2 h；二甲苯脫蠟水化后抗原修復(fù)，3%H2O2反應(yīng)10 min除去內(nèi)源性過氧化物酶。隨后，4 ℃冰箱內(nèi)一抗過夜孵育，二抗于室溫下孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水后封片后鏡檢。使用PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：每張切片隨機選擇5個不同高倍視野，MMP-2和TIMP-4均以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒為陽性，結(jié)果判斷采用半定量積分法。結(jié)果按細(xì)胞著色強度分為：無陽性著色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強染色為3分；同時按陽性細(xì)胞百分比分為：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～2分為(-)；3～4分為(+)；6～8分為()；9～12分為()，其中≥6分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同結(jié)直腸組織中MMP-2、TIMP-4的表達(dá)選取20例新鮮結(jié)直腸腺癌及對應(yīng)正常腸組織進(jìn)行qRT-PCR實驗，結(jié)果顯示MMP-2和TIMP-4的mRNA在結(jié)直腸腺癌和正常腸組織中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。Western blot實驗檢測MMP-2和TIMP-4蛋白在結(jié)直腸腺癌及正常腸組織中表達(dá)，結(jié)果顯示MMP-2和TIMP-4在結(jié)直腸腺癌組織中均呈高表達(dá)，而在正常腸組織中低表達(dá)(圖2)。免疫組化實驗結(jié)果顯示，MMP-2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀(圖3)，且MMP-2蛋白在結(jié)直腸腺癌中高表達(dá)，在HGIN、LGIN和正常腸組織中相對低表達(dá)，分別為81.11%(73/90)、63.33%(19/30)、40.00%(12/30)和18.00%(9/50)。TIMP-4蛋白在細(xì)胞質(zhì)中染色呈棕黃色(圖4)；TIMP-4蛋白在結(jié)直腸腺癌、HGIN、LGIN和正常腸組織中的陽性率分別為87.78%(79/90)、73.33%(22/30)、40.00%(12/30)和26.00%(13/50)。MMP-2和TIMP-4蛋白在結(jié)直腸腺癌、HGIN、LGIN和正常腸組織中的表達(dá)差異均有顯著性(P<0.001，表1)。

圖1 qRT-PCR實驗檢測MMP-2、TIMP-4的mRNA在結(jié)直腸腺癌及正常腸組織中的表達(dá)：A.MMP-2；B.TIMP-4

表1 不同結(jié)直腸組織中MMP-2與TIMP-4的表達(dá)[n(%)]

2.2 結(jié)直腸腺癌中MMP-2與TIMP-4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在結(jié)直腸腺癌組織中，MMP-2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)，而與術(shù)前CEA、術(shù)前CA19-9、性別、年齡、脈管浸潤無明顯相關(guān)性；TIMP-4蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分級、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、術(shù)前CEA、術(shù)前CA19-9、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(表2)。

圖2 Western blot實驗檢測MMP-2、TIMP-4蛋白在結(jié)直腸腺癌組織及正常腸組織中的表達(dá)：N.正常組織；T.腫瘤組織

③A③B③C③D④A④B④C④D

2.3 結(jié)直腸腺癌組織中MMP-2和TIMP-4表達(dá)的相關(guān)性結(jié)直腸腺癌組織中，MMP-2和TIMP-4蛋白均陽性者67例，均陰性者5例，Pearson相關(guān)性分析顯示在結(jié)直腸腺癌中MMP-2與TIMP-4蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.253，P=0.016，表3)。

3 討論

隨著環(huán)境及生活方式的改變，結(jié)直腸腺癌成為嚴(yán)重影響人們健康的惡性疾病之一。早期發(fā)現(xiàn)、早期切除可能惡變的結(jié)直腸息肉，是預(yù)防結(jié)直腸腺癌的重要途徑[4,6-7]。目前結(jié)直腸腺癌的治療主要采用手術(shù)并輔以化療，但是其效果不佳，患者預(yù)后較差。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，同時也是直接影響患者治療效果以及預(yù)后的主要因素?，F(xiàn)有研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)可作為防止腫瘤轉(zhuǎn)移的主要防護(hù)屏障，腫瘤細(xì)胞突破周圍的基底膜進(jìn)入ECM是腫瘤發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的重要過程[8]。

目前已有研究表明MMP-2與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤及腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)[9]。在病理狀態(tài)下，MMP-2可促進(jìn)細(xì)胞分泌多種生長因子，促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長，增強腫瘤細(xì)胞的增殖能力；同時MMP-2還可以促進(jìn)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)腫瘤微血管及微環(huán)境血液循環(huán)的形成；與此同時還與ECM的降解密切相關(guān)，致使癌細(xì)胞突破ECM屏障，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[10-12]。MMP-2是參與ECM降解的主要成分[13]。本組免疫組化結(jié)果顯示MMP-2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、TNM分期關(guān)系密切，提示MMP-2高表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。

表2 結(jié)直腸腺癌中MMP-2與TIMP-4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 結(jié)直腸腺癌中MMP-2與TIMP-4表達(dá)的相關(guān)性

TIMP在維持ECM穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用。TIMP不僅能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡，同時還促進(jìn)血管生成以及MMP前肽的激活。在大多數(shù)生物學(xué)過程中，TIMP通過與MMP形成1∶1復(fù)合物來抑制MMP的表達(dá)，從而減弱腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[14-15]。TIMP-4是新合成的TIMP家族的生物大分子，可以通過與MMP-2及其前體結(jié)合來抑制MMP-2的生物學(xué)活性[11]。本實驗結(jié)果表明TIMP-4蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌腫瘤大小、腫瘤分級以及TNM分期密切相關(guān)，且TIMP-4蛋白的變化水平可影響MMP-2蛋白表達(dá)。

本實驗首次在結(jié)直腸腺癌及正常組織中檢測MMP-2和TIMP-4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2和TIMP-4在結(jié)直腸腺癌中高表達(dá)，且具有顯著相關(guān)性(P<0.001)。在免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)，部分HGIN的MMP-2與TIMP-4蛋白檢測呈陽性，可能是由于在臨床治療過程中，HGIN患者的手術(shù)切除往往伴隨癌性病變，本實驗尚未對其進(jìn)行qRT-PCR檢測；并且組織樣本來源較為單一，可能存在地區(qū)及個體差異。因此，目前應(yīng)用于臨床患者的檢測仍存在一定的局限性。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示MMP-2和TIMP-4蛋白在結(jié)直腸腺癌中高表達(dá)，推測MMP-2和TIMP-4蛋白的代謝失調(diào)可能參與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究對診斷及治療結(jié)直腸腺癌提供治療新思路和生物學(xué)研究的新方向，但其如何調(diào)節(jié)結(jié)直腸腺癌的生物學(xué)行為的分子機制仍需進(jìn)一步探討。