枸杞多糖對(duì)大鼠任意皮瓣術(shù)后炎性反應(yīng)的影響

王麗梅，丁 冬，孫 健

軟組織缺損型創(chuàng)傷的修復(fù)是臨床面臨的一個(gè)棘手問(wèn)題，隨著顯微外科技術(shù)和顯微器械的發(fā)展，皮瓣移植技術(shù)已成為解決這一難題的有效手段[1-2]。皮瓣移植手術(shù)在完成組織血流重建的同時(shí)，發(fā)生缺血-再灌注損傷(IRI)的風(fēng)險(xiǎn)增高，這也成為組織器官移植領(lǐng)域共同面臨的棘手問(wèn)題[3]。創(chuàng)傷及手術(shù)應(yīng)激可使內(nèi)皮素、兒茶酚胺等縮血管的炎性物質(zhì)大量釋放，進(jìn)一步加重IRI[4]，因此皮瓣術(shù)后炎性反應(yīng)是影響皮瓣預(yù)后的一個(gè)重要因素。枸杞多糖(LBP)作為枸杞的有效成分，被許多研究證明具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、控制血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[5-6]。既往的研究主要針對(duì)LBP對(duì)一些慢性病的治療效果的探討，然而LBP對(duì)創(chuàng)傷、手術(shù)等急性應(yīng)激早期的炎性反應(yīng)有何影響？這一問(wèn)題少見(jiàn)研究報(bào)道。我們擬將LBP應(yīng)用于皮瓣修復(fù)大鼠軟組織缺損的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，觀察LBP對(duì)皮瓣修復(fù)大鼠軟組織缺損型中炎性反應(yīng)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)近交系9周齡SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄性，質(zhì)量為180～220 g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批通過(guò)，符合動(dòng)物倫理要求，合格證號(hào)：SCXK(寧)2017-0001。

1.1.2 主要儀器和試劑：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)(山東麗澤寵物用品有限公司)，顯微外科手術(shù)器械(寧波市成和顯微器械廠)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)LEICA)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)，全自動(dòng)生化分析儀(中國(guó)邁瑞)，純度75%的LBP粉劑(寧夏杞瑞康有限公司)，炎性因子(TNF-α、IL-6、MIP-1α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海艾博抗貿(mào)易有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。A組為空白對(duì)照組，未行皮瓣手術(shù)的SD大鼠正常飼養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組分B、C、D、E 4組，每組8只；B組為生理鹽水組，于模型制備前1 d用生理鹽水連續(xù)灌胃10 d；C、D、E為L(zhǎng)BP組，于模型制備前1 d用LBP溶液連續(xù)灌胃10 d，劑量分別為0.2、0.4、0.8 g/(kg·d)。

1.2.2 大鼠背部任意皮瓣模型制備[7]：按照4 mL/kg的劑量使用10%的水合氯醛對(duì)SD大鼠行腹腔麻醉。麻醉生效后，備皮、消毒，按設(shè)計(jì)線在背部依次切開皮膚、皮下組織、肌膜，在肌膜淺面剝離，掀起4 cm×2 cm的隨意皮瓣，皮瓣中不含軸心血管，蒂部在頸部，離枕骨下端1.0 cm處。皮瓣下方放置無(wú)菌硅膠片，皮瓣原位縫合。每日大鼠腹腔注射青霉素20萬(wàn)單位預(yù)防感染，連用3 d，勤換墊料以防止?jié)儼l(fā)生。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別單籠飼養(yǎng)，觀察各組大鼠皮瓣的顏色變化、腫脹程度、毛發(fā)生長(zhǎng)、有無(wú)滲出等。

1.2.3 皮瓣成活率測(cè)算[8]：造模后12 d皮瓣的成活與壞死界限清楚，處死實(shí)驗(yàn)組大鼠，用硫酸紙臨摹測(cè)量皮瓣的成活面積，描繪皮瓣的形態(tài)、成活區(qū)域及壞死區(qū)域，用天平秤量皮瓣成活部分和壞死部分的質(zhì)量。皮瓣成活面積百分比，即成活皮瓣質(zhì)量/(成活皮瓣質(zhì)量+壞死皮瓣質(zhì)量)×100%，各組皮瓣成活面積百分比的平均數(shù)即為皮瓣成活率。

1.2.4 皮瓣組織形態(tài)學(xué)觀察：各組于造模后24、48 h、7 d 麻醉一只標(biāo)本，切取1 cm×0.5 cm 皮瓣成活區(qū)域的組織塊，常規(guī)固定、脫水后制作冰凍切片，厚6 μm，行HE染色，于光鏡下觀察組織學(xué)變化，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管分布情況等。

1.2.5 炎性因子檢測(cè)：于造模后即刻、12、24、48、72 h及7、10 d 抽取大鼠眼內(nèi)眥靜脈血，離心后取血清，送標(biāo)本至寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的含量。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察：切取大鼠背部任意皮瓣，確認(rèn)皮瓣中不含軸心血管。同A組相比，造模術(shù)后12 h各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣膚色紅潤(rùn)，未見(jiàn)明顯腫脹，創(chuàng)緣可見(jiàn)少量血性滲出；造模后24 h各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣較前腫脹，張力增高，膚色紅潤(rùn)，皮溫較正常組織低；造模后48 h各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣明顯腫脹，張力明顯增高，膚色暗紅，皮溫發(fā)涼，造模后各實(shí)驗(yàn)組大鼠運(yùn)動(dòng)及進(jìn)食減少，上述表現(xiàn)以B組顯著；造模后72 h，各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣整體腫脹減輕，但皮瓣遠(yuǎn)端腫脹明顯，運(yùn)動(dòng)及進(jìn)食開始增加，其中E組大鼠皮瓣腫脹程度輕，張力低，膚色紅潤(rùn)，皮溫接近正常組織，近端長(zhǎng)出毛發(fā)；造模后7 d 各實(shí)驗(yàn)組皮瓣呈現(xiàn)不同程度壞死，表現(xiàn)為焦痂樣，色黑，質(zhì)硬，皺縮，遠(yuǎn)端較近端重，以B組最明顯，E組不明顯。

2.2 皮瓣成活率測(cè)算結(jié)果：B、C、D、E組大鼠于造模后12 d的皮瓣成活率中位數(shù)分別為15.92%、47.52%、64.14%、83.68%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組皮瓣成活率中位數(shù)兩兩比較結(jié)果顯示，C、D、E組皮瓣成活率中位數(shù)均高于B組皮瓣成活率中位數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.76，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組皮瓣成活率(%)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 皮瓣組織形態(tài)學(xué)觀察：造模24 h后各實(shí)驗(yàn)組大鼠切片可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，主要集中在靠近蒂部的組織，中段組織表現(xiàn)為出血，遠(yuǎn)端組織腫脹，滲出明顯(圖1A，目錄后)；48 h后B組切片可見(jiàn)近端蒂部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，中段組織亦出現(xiàn)炎性細(xì)胞，出血加重，遠(yuǎn)端組織少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腫脹及滲出明顯，未見(jiàn)壞死細(xì)胞(圖1B，目錄后)，E組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腫脹程度輕(圖1C，目錄后)；7 d后B組近端炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，可見(jiàn)新生毛細(xì)血管，密度不均，中段組織炎性細(xì)胞集中浸潤(rùn)，可見(jiàn)散在新生毛細(xì)血管，呈點(diǎn)狀及灶狀壞死組織，遠(yuǎn)端組織表皮和真皮結(jié)構(gòu)消失，呈片狀壞死(圖1D，目錄后)；E組近端炎性細(xì)胞明顯減少，新生毛細(xì)血管豐富，蔓延至皮瓣中遠(yuǎn)端，遠(yuǎn)端組織有散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕微腫脹，皮下呈點(diǎn)狀壞死狀(圖1E，目錄后)。

2.4 炎性因子檢測(cè)結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組大鼠造模后即刻檢測(cè)TNF-α、IL-6、MIP-1α的水平較A組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后12、24、48、72 h及7、10 d檢測(cè)炎性因子的水平較A組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2-表4。

表2 造模后不同時(shí)間各組小鼠血清TNF-a水平的比較

表3 造模后不同時(shí)間各組小鼠血清IL-6水平的比較

表4 造模后不同時(shí)間各組小鼠血清MIP-1α水平的比較

3 討論

皮瓣移植已成為目前臨床治療軟組織缺損型創(chuàng)傷的主要技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切取SD大鼠頸背部任意皮瓣并原位縫合，作為皮瓣修復(fù)軟組織缺損創(chuàng)傷的動(dòng)物模型。SD大鼠頸背部皮下筋膜組織少，視其頸背部任意皮瓣為超薄穿支皮瓣，切取皮瓣的長(zhǎng)寬比例為2∶4，這與王白石等[7-8]的造模方法一致。該類型任意皮瓣成活的血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)為近端靠蒂部的血管，遠(yuǎn)端由創(chuàng)基和創(chuàng)周的微循環(huán)重建來(lái)供血[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)皮瓣組織切片觀察顯示，皮瓣中段及遠(yuǎn)端毛細(xì)血管再生要早于近端，且遠(yuǎn)端數(shù)量多，新生血管的分布規(guī)律符合上述任意皮瓣的成活機(jī)制。

根據(jù)既往研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為皮瓣移植模型中IRI與炎性因子的釋放是互為因果、相互促進(jìn)的過(guò)程。皮瓣移植術(shù)后，使原來(lái)缺血的局部組織重建血液循環(huán)，發(fā)生IRI。與此同時(shí)，創(chuàng)傷、手術(shù)等急性應(yīng)激使內(nèi)皮素、兒茶酚胺等縮血管的炎性物質(zhì)大量釋放，微血管尤其是動(dòng)脈血管收縮，血流量減少，同時(shí)缺血導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物過(guò)多蓄積，損傷組織細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞也受損，血小板黏附、聚集并形成血栓，阻斷血流，進(jìn)一步加重IRI[10-12]。TNF-α是一種由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其含量可反映早期炎性反應(yīng)嚴(yán)重程度；IL-6是由T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等生成的具有調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子，在嚴(yán)重創(chuàng)傷、大手術(shù)后等應(yīng)激過(guò)程早期可明顯增高，和炎性反應(yīng)密切相關(guān)，被稱為炎性反應(yīng)的促發(fā)劑；MIP-1α介導(dǎo)其他細(xì)胞因子的釋放，除對(duì)T細(xì)胞、單核細(xì)胞具有趨化能力外，還對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用，而且與IRI的程度呈正相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)于造模后即刻檢測(cè)各組TNF-α、IL-6、MIP-1a的含量，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組三種炎性因子的含量均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明三種炎性因子在皮瓣手術(shù)應(yīng)激早期反應(yīng)性升高，誘導(dǎo)或加重IRI的發(fā)生，同時(shí)IRI又導(dǎo)致炎性反應(yīng)失衡，破壞皮瓣組織生長(zhǎng)的微環(huán)境。

LBP是枸杞中最重要的有效成分，它所具有抗老化、保護(hù)神經(jīng)、抗疲勞、控制血糖、抗氧化、抗腫瘤等功效已經(jīng)被廣泛的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用所證實(shí)[13-15]。它能夠通過(guò)上調(diào)VEGF的生成從而改善動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠的血管新生，也可通過(guò)上調(diào)NGF的生成從而抑制損傷神經(jīng)再生過(guò)程中神經(jīng)瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，LBP可以調(diào)節(jié)機(jī)體在病理?xiàng)l件下某些相關(guān)因子的表達(dá)，從而維持機(jī)體所需的穩(wěn)定的微環(huán)境。然而既往對(duì)LBP功效的研究主要針對(duì)一些慢性病的治療，其對(duì)創(chuàng)傷、手術(shù)等急性應(yīng)激導(dǎo)致的IRI及炎性反應(yīng)的動(dòng)態(tài)失衡效果如何這一問(wèn)題少見(jiàn)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同濃度的LBP應(yīng)用于皮瓣修復(fù)大鼠軟組織缺損模型，對(duì)各組TNF-α、IL-6、MIP-1a含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組于造模后48 h炎性反應(yīng)達(dá)高峰，之后炎性因子水平逐漸下降，造模后12、24、48、72 h及7、10 d檢測(cè)炎性因子的水平較空白對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度LBP組炎性因子含量在各時(shí)間點(diǎn)均低于其他組。皮瓣成活率的測(cè)算結(jié)果顯示LBP組的皮瓣成活率高于生理鹽水組，高濃度LBP的皮瓣成活率高于其它各組。上述結(jié)果說(shuō)明皮瓣修復(fù)大鼠軟組織缺損型創(chuàng)傷術(shù)后炎性反應(yīng)加重，LBP可以下調(diào)皮瓣術(shù)后炎性因子的表達(dá)，減輕IRI，促進(jìn)皮瓣成活。

LBP是如何下調(diào)皮瓣術(shù)后炎性因子的表達(dá)并促進(jìn)皮瓣成活，我們分析LBP作為一種多糖，能夠補(bǔ)充各種應(yīng)激反應(yīng)早期的糖原消耗，為機(jī)體代謝提供能量動(dòng)力，減輕缺血、缺氧，減輕IRI，抑制炎性反應(yīng)加重。另外，LBP可能使遭受急性應(yīng)激反應(yīng)的組織中抗氧化酶活性升高，提高抗氧化能力，清除超氧陰離子自由基，減輕過(guò)氧化反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激，恢復(fù)并維持組織細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，從而保護(hù)細(xì)胞，改善血管彈性，重建微循環(huán)。