新型冠狀病毒核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)探討*

李淵婷，高小玲，李永紅△

(甘肅省人民醫(yī)院：1.臨床研究與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所；2.國家衛(wèi)生健康委胃腸腫瘤診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730030)

自2019年12月底湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染患者以來，院內(nèi)感染及對(duì)病毒傳播途徑認(rèn)知不足致使生物安全防護(hù)欠缺或不到位是導(dǎo)致醫(yī)務(wù)人員暴露并感染的重要原因[1]。

SARS-CoV-2是人類分離的第七類冠狀病毒，屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜的單股正鏈RNA病毒，直徑60～140 nm，形態(tài)不一，多為圓形或橢圓形。其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有明顯區(qū)別[2]，但都是通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)感染細(xì)胞。目前研究顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性達(dá)85%以上。體外分離培養(yǎng)時(shí)，SARS-CoV-2 96 h左右即可在人呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，而在Vero E6和Huh-7細(xì)胞系中分離培養(yǎng)需約6 d。對(duì)冠狀病毒理化特性的認(rèn)識(shí)多來自對(duì)SARS-CoV和MERS-CoV的研究。病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒[2]。

我國2020年1月20日將新型冠狀病毒肺炎納入乙類傳染病并采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。SARS-CoV-2傳染源主要為確診患者，潛伏期患者和攜帶者也有傳染性，潛伏期1～14 d，人群普遍易感。傳播途徑除了主要的呼吸道飛沫傳播、接觸傳播，新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)新增一條傳播途徑：在相對(duì)封閉的環(huán)境中長時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[2]。對(duì)于潛在的氣溶膠傳播途徑而言，核酸檢測的實(shí)驗(yàn)室是高危科室，檢測人員在實(shí)驗(yàn)過程中存在較大的感染風(fēng)險(xiǎn)，因此，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)顯得極為重要。本文從實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)、個(gè)人生物安全防護(hù)、核酸檢測過程生物安全防護(hù)等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所處理對(duì)象的生物危害程度和采取的防護(hù)措施，實(shí)驗(yàn)室生物安全分為4個(gè)等級(jí)：一級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL-1)、二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL-2)、三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL-3)、四級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL-4)。我國將SARS-CoV-2按照病原微生物危害程度分類中第二類高致病性病原微生物進(jìn)行管理,其分離培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等活動(dòng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展，病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、核酸檢測、生化分析等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展，其中核酸檢測盡可能在有外排功能的生物安全柜中進(jìn)行[3]。

SARS-CoV-2核酸檢測必須在標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室或負(fù)壓PCR實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，檢測人員按三級(jí)生物安全防護(hù)進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室作業(yè)，嚴(yán)格遵守試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)單一流向的原則，防止氣溶膠逆向流動(dòng)，造成污染[4]。

核酸檢測實(shí)驗(yàn)前檢查生物安全柜，保證其內(nèi)盡量少放物品，以便生物安全柜內(nèi)形成穩(wěn)定且潔凈的氣流循環(huán)。用75%乙醇對(duì)試劑準(zhǔn)備區(qū)及標(biāo)本制備區(qū)生物安全柜和臺(tái)面進(jìn)行消毒后紫外線照射30 min，打開安全柜風(fēng)機(jī)運(yùn)行15～30 min后開始實(shí)驗(yàn)。生物安全柜中應(yīng)配備利器盒，裝0.55%～1.00%含氯消毒液用于丟棄標(biāo)本、廢液及與試劑、標(biāo)本接觸過的實(shí)驗(yàn)耗材(槍頭、EP管等)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)區(qū)域進(jìn)行消毒，依次用75%乙醇及1.00%含氯消毒劑對(duì)安全柜臺(tái)面、移液器等用品和地面進(jìn)行消毒，安全柜風(fēng)機(jī)至少運(yùn)行10 min后方可關(guān)機(jī)。用75%乙醇對(duì)空氣進(jìn)行消毒，10 min后開啟通風(fēng)裝置10 min，關(guān)閉通風(fēng)裝置后打開安全柜及實(shí)驗(yàn)室的紫外燈照射30 min[5]，注意紫外燈距臺(tái)面0.9 m以內(nèi)，密閉30 min以上，人員離開。紫外燈照射后，為有效去除實(shí)驗(yàn)過程中的氣溶膠，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行通風(fēng)至少1 h，實(shí)驗(yàn)室不定期通風(fēng)是重要的防護(hù)措施。

實(shí)驗(yàn)過程中如有生物安全操作失誤或意外，對(duì)污染的臺(tái)面使用0.55%含氯消毒劑的紙巾覆蓋消毒30 min以上，消毒劑現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h內(nèi)使用[4]。實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)，除了覆蓋消毒30 min之外，要保持實(shí)驗(yàn)室密閉，必要時(shí)過氧乙酸加熱熏蒸過夜，劑量為2 g/m3。清理污染物嚴(yán)格遵循病毒生物安全操作要求，高壓蒸汽滅活病毒，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)換氣，防止次生危害[6]。

2 個(gè)人生物安全防護(hù)

檢測人員個(gè)人生物安全防護(hù)是SARS-CoV-2核酸檢測生物安全防護(hù)的重點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室人員生物安全防護(hù)按不同等級(jí)病原微生物所采取的不同綜合防護(hù)措施可分為3級(jí)：具體防護(hù)用品分配見表1[6-7]。SARS-CoV-2核酸檢測過程中檢測人員為三級(jí)生物安全防護(hù)，嚴(yán)格遵循其穿脫順序是保護(hù)檢測人員、避免院內(nèi)感染的重點(diǎn)防護(hù)措施，具體步驟見圖1、2。

表1 個(gè)人生物安全防護(hù)分級(jí)

注：●為應(yīng)選擇，*為根據(jù)暴露風(fēng)險(xiǎn)選擇，空白為無需選擇。

2.1防護(hù)用品的穿戴注意事項(xiàng) 除嚴(yán)格遵守穿戴順序外，手衛(wèi)生也是不可忽視的重點(diǎn)，可采用有效碘含量為0.5%、75%乙醇或70%異丙醇的消毒劑浸泡或擦拭手部，作用1～3 min，然后用醫(yī)用洗手液按照“七步洗手法”洗凈雙手。每次佩戴口罩前應(yīng)做佩戴氣密性檢查，戴兩層口罩時(shí)，內(nèi)層為醫(yī)用防護(hù)口罩或N95，外層為醫(yī)用外科口罩。戴無菌手套時(shí)手套反折，緊套袖口防止手套污染。

圖1 三級(jí)防護(hù)的穿戴流程

圖2 三級(jí)防護(hù)的脫摘流程

2.2防護(hù)用品摘脫的注意事項(xiàng) 脫下的護(hù)目鏡、防護(hù)靴等非一次性使用的物品可用75%乙醇浸泡30 min后紫外消毒30 min備用。脫防護(hù)服時(shí)要注意，脫去第一層手套后，進(jìn)行手部消毒后再脫防護(hù)服，如果是一次性防護(hù)服，可用手接觸防護(hù)服內(nèi)側(cè)，緩慢從上到下脫去防護(hù)服置于三層黃色醫(yī)療垃圾袋中；如果是可重復(fù)使用的防護(hù)服，用75%乙醇均勻噴灑后，用消毒后的內(nèi)層手套，僅接觸防護(hù)服外側(cè)脫去防護(hù)服，然后將防護(hù)服進(jìn)行紫外照射至少30 min后備用，脫卸防護(hù)裝備的每一步均應(yīng)進(jìn)行手消毒。注意摘口罩時(shí)不要觸碰正面，摘脫多個(gè)防護(hù)用品時(shí)，務(wù)必確保醫(yī)用防護(hù)口罩最后摘除。將手套、醫(yī)用防護(hù)帽、鞋套，防護(hù)服等放入三層黃色醫(yī)療垃圾袋中作為醫(yī)療廢物集中高壓滅活病毒。

脫防護(hù)服時(shí)其表面的氣溶膠、噴濺液體容易浮在空氣中，應(yīng)盡量減少呼吸頻率，減少語言交流，并閉上眼睛。所有防護(hù)裝備全部脫完后再次洗手、手消毒；按流程脫去之后，用乙醇或碘制劑，擦拭暴露的面部、鼻孔(適當(dāng)深度)、耳部和耳道。建議脫去之后用生理鹽水滴眼睛、漱口，如果條件許可，脫下防護(hù)服后，盡快更換隔離服，洗澡且時(shí)長應(yīng)超過30 min。

3 檢測流程中的生物安全防護(hù)

3.1標(biāo)本采集及運(yùn)輸?shù)淖⒁馐马?xiàng) SARS-CoV-2核酸檢測標(biāo)本主要包括上呼吸道標(biāo)本(口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物等)、下呼吸道標(biāo)本(深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液和肺組織活檢標(biāo)本等)、發(fā)病期血液及糞便[5]。標(biāo)本采集時(shí)必須保證采集者為三級(jí)生物安全防護(hù)[6]。據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，最常用的咽拭子標(biāo)本核酸檢出率偏低，靈敏度不高，而下呼吸道標(biāo)本的陽性率相對(duì)較高，有專家推薦使用深咳痰標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測，采集深咳痰時(shí)建議用3%的生理鹽水6 mL，霧化吸入15 min，由采集者從下至上輕輕手拍患者背部，誘導(dǎo)排痰。針對(duì)無法采集痰液標(biāo)本的患者，仍需采集咽拭子進(jìn)行核酸檢測，但應(yīng)注意采集拭子的材料、采集部位、深度等影響核酸檢測的因素。

標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)人員為二級(jí)生物安全防護(hù)[6]，采集標(biāo)本后用75%乙醇噴灑標(biāo)本采集管外部，放入專用兩層一次性密封袋，75%乙醇消毒后放入轉(zhuǎn)運(yùn)箱(有生物安全標(biāo)識(shí))，消毒并及時(shí)送檢，轉(zhuǎn)運(yùn)工作要在2 h內(nèi)完成。轉(zhuǎn)運(yùn)人員隨身攜帶75%乙醇，處理可能發(fā)生的意外[5]。但《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測的生物安全防護(hù)指南》指出，如發(fā)生意外，轉(zhuǎn)運(yùn)者不要自行處理轉(zhuǎn)運(yùn)箱，需到接收地點(diǎn)說明情況，同接收人員共同處理[6]。在此，筆者認(rèn)為轉(zhuǎn)運(yùn)者應(yīng)隨聲攜帶75%乙醇，當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)箱密封性損傷時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)者可及時(shí)進(jìn)行緊急消毒處理；當(dāng)標(biāo)本發(fā)生灑漏，則到接收地點(diǎn)同接收人員共同處理。

3.2標(biāo)本接收的注意事項(xiàng) 接收人員為二級(jí)生物安全防護(hù)[6]，標(biāo)本進(jìn)行雙簽收后，接收人員用75%乙醇對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)箱外部進(jìn)行消毒，靜置3～5 min后，小心打開轉(zhuǎn)運(yùn)箱后再次對(duì)箱子內(nèi)部及密封袋消毒，檢查標(biāo)本運(yùn)送過程中有無撒漏并核對(duì)患者信息，然后將標(biāo)本放入儲(chǔ)存盒中置于專用冰箱4 ℃冷藏(不超過24 h)保存，長期保存可置于-70 ℃或更低溫度下保存，血漿標(biāo)本可在4 ℃存放3 d，-20 ℃長期保存。標(biāo)本采集，轉(zhuǎn)運(yùn)，交接環(huán)節(jié)應(yīng)有記錄，以便回溯。

3.3核酸檢測中的注意事項(xiàng) 檢測人員采用三級(jí)生物安全防護(hù)[6]，進(jìn)入核酸檢測實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格按照PCR實(shí)驗(yàn)室單一流向進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中可能會(huì)有高濃度氣溶膠的產(chǎn)生，因此，可加戴一個(gè)帽子，防護(hù)服外加穿隔離衣，穿上防護(hù)服后，要避免劇烈運(yùn)動(dòng)，減少內(nèi)外氣體流動(dòng)，防止帶入氣溶膠附著在內(nèi)部衣物上。

試劑準(zhǔn)備區(qū)配置實(shí)驗(yàn)試劑后，進(jìn)入標(biāo)本處理區(qū)。標(biāo)本處理應(yīng)在具有外排功能的生物安全柜中進(jìn)行。口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、糞便置于水浴箱中56 ℃ 45 min進(jìn)行病毒滅活[5]，每10 min輕輕搖勻一次，滅活后靜置10 min(防止產(chǎn)生氣溶膠，靜置時(shí)間越長，產(chǎn)生氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)越小)用于核酸提取；痰液標(biāo)本應(yīng)提前40 min加入痰消化儲(chǔ)存液、含1 g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液[5]或4%NAOH液化處理后進(jìn)行病毒滅活。血液標(biāo)本1 500×g離心10 min后冰浴3～5 min后進(jìn)行核酸提取?！缎滦凸跔畈《痉窝讓?shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南(第四版)》指出血清標(biāo)本主要用于抗體測定[8]，從血清抗體水平對(duì)病例感染狀況進(jìn)行確定，血清標(biāo)本不進(jìn)行核酸檢測，而血漿標(biāo)本可用于核酸檢測，建議核酸檢測使用含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管采集血液標(biāo)本5 mL。

提取核酸時(shí)，戴雙層手套(外層需為無粉丁腈手套)小心旋轉(zhuǎn)標(biāo)本盒螺口，打開標(biāo)本盒后，吸取足量標(biāo)本，將標(biāo)本盒蓋緊。剩余標(biāo)本放入密封袋中，表面噴灑75%乙醇后重新放入儲(chǔ)存盒，再放入標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)。標(biāo)本離心時(shí)，檢測人員不能離開離心機(jī)。正常離心結(jié)束后，靜置10 min以上(有效減少氣溶膠的形成)，75%乙醇噴霧消毒后，開離心機(jī)蓋噴霧消毒，轉(zhuǎn)入生物安全柜中。如果疑似意外發(fā)生，比如離心過程有異常聲響，則停止離心，離心停止30 min以上，75%乙醇噴霧消毒后，開離心機(jī)蓋噴霧消毒。按實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)外層手套污染或破損時(shí)，用75%乙醇消毒后棄去外層手套，對(duì)內(nèi)層手套用75%乙醇消毒后更換新外層手套。皮膚被污染物污染時(shí)，應(yīng)立即清除污染物，再用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏或過氧化氫消毒劑擦拭消毒3 min以上，使用清水清洗干凈；黏膜污染時(shí)應(yīng)用大量生理鹽水沖洗或0.05%碘伏沖洗消毒。操作過程中不能用75%乙醇對(duì)空氣消毒。核酸提取完成后在生物安全柜內(nèi)將模板加入PCR擴(kuò)增體系中。標(biāo)本檢測過程中的槍頭、離心管、廢液等與標(biāo)本接觸的耗材放入盛有1%含氯消毒劑的黃色利器盒中浸泡30 min以上，蓋緊利器盒，按醫(yī)療廢物處置方法處置。擴(kuò)增體系放入擴(kuò)增儀，核對(duì)并運(yùn)行擴(kuò)增程序。標(biāo)本檢測結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物放入三層黃色醫(yī)療垃圾袋中封存高壓；檢測后滅活的標(biāo)本密封后放在專用的冰箱中，設(shè)立專人管理，雙人雙鎖做好登記。

檢測過程中的利器盒及檢測人員的防護(hù)服、手套、鞋套、帽子等廢棄物用75%乙醇消毒后收集于三層醫(yī)療廢物包裝袋，鵝頸結(jié)密封，并標(biāo)注為新型冠狀病毒肺炎。經(jīng)過高壓滅活病毒后，由專員統(tǒng)一處理。

本次疫情對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全防控體系是一場考驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)和個(gè)人生物安全防護(hù)都是避免院內(nèi)感染的重要環(huán)節(jié)。每個(gè)醫(yī)務(wù)工作者都應(yīng)該提高生物安全防控意識(shí)，從工作中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，吸取教訓(xùn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和改善不足，不斷完善實(shí)驗(yàn)室生物安全防控體系，做到精準(zhǔn)檢測的同時(shí)有效保護(hù)每一位醫(yī)務(wù)人員。