建立穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的B16R細(xì)胞系

柯宗煌，王磊蘭，高 卉*，劉濱磊

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會(huì)生物科技股份有限公司)

黑色素瘤雖然僅占所有惡性腫瘤的1%～3%，但以6%～7%的增長速度逐年增加，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，免疫療法成為腫瘤治療的一大熱門，其中包括溶瘤病毒療法、PD1單抗和PDL1單抗療法等。在這些腫瘤免疫療法研究中，一些體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，用肉眼去計(jì)數(shù)細(xì)胞的存活數(shù)目或者觀察計(jì)算動(dòng)物腫瘤體積，這都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)研究存在精確定量性和客觀性的偏差[2]。因此，本研究采用黑色素瘤細(xì)胞系(B16R)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的B16R-FLUC細(xì)胞系，用化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行熒光素酶基因的鑒定，并用C57小鼠進(jìn)行皮下移植黑色素瘤實(shí)驗(yàn)，用活體成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照觀察，檢測B16R-FLUC細(xì)胞的成瘤性，從而為黑色素瘤藥物臨床前的體外殺傷實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)提供了新的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)而為臨床前研究黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制和判斷藥物治療效果提供了全新的技術(shù)手段[3]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

C57小鼠購于湖北省疾控中心，B16R細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院贈(zèng)與)。

1.1.2 試劑與儀器

DME/F12培養(yǎng)基購于Hyclone公司；胎牛血清購于四季青公司；嘌呤霉素購于賽國生物科技有限公司，異氟烷購于支誠生物公司，PBS購于JET公司，lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司，PiggyBac-Dual-Promoter-Firefly Luciferase(PBDP-FLUC)重組質(zhì)粒和PBDP轉(zhuǎn)座酶(本實(shí)驗(yàn)室提供)。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本松下公司，熒光倒置顯微鏡購自奧林巴斯公司，動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購于PE公司，多功能酶標(biāo)儀和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自賽默飛(Thermo Fisher Scientific)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取一支B16R細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清DME/F-12，將細(xì)胞置37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的黑色素瘤細(xì)胞稀釋至細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于六孔板中，每孔含10%胎牛血清的培養(yǎng)基體積為2mL，待六孔板中細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，棄去孔中培養(yǎng)基，加入新鮮配制的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系，其中脂質(zhì)體5μL，帶有熒光素酶基因和綠色熒光蛋白基因的重組質(zhì)粒(PBDP-FLUC)10μL，PBDP轉(zhuǎn)座酶40μL，充分混勻，再補(bǔ)加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基2mL，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2d觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.2.3 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

對(duì)照組用連續(xù)硬膜外麻醉,側(cè)臥,穿刺L3-4穿刺,針頭進(jìn)入硬膜外腔,分次將麻醉藥物(1%利多卡因+0.2%地卡因)注入。

將六孔板中轉(zhuǎn)染的B16R細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察，視野下有20%～30%的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，然后棄去原有培養(yǎng)基，補(bǔ)加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，并加入嘌呤霉素，使其最終濃度為5μg/μL，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換一次培養(yǎng)基并加5μL濃度為1μg/μL的嘌呤霉素，并用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)綠色熒光情況，待視野下發(fā)綠色熒光細(xì)胞比例達(dá)到80%以上，將六孔板中細(xì)胞消化下來，稀釋細(xì)胞濃度至10個(gè)/mL，接種于96孔板中，第2d用熒光顯微鏡觀察，將細(xì)胞全部發(fā)綠色熒光的孔作上標(biāo)記，將96孔板細(xì)胞放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待已作標(biāo)記的孔中細(xì)胞長滿。

1.2.4 篩選細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)

將96孔板中的陽性細(xì)胞(B16R-FLUC)消化下來，接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)后如檢測有Firefly luciferase高表達(dá)，則大量擴(kuò)增B16R-FLUC細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后進(jìn)行凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.5 化學(xué)發(fā)光檢測B16R-FLUC細(xì)胞熒光素酶基因的表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)組B16R-FLUC細(xì)胞和對(duì)照組B16R細(xì)胞消化下來，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，兩組細(xì)胞分別按1×106個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL稀釋后，每種細(xì)胞濃度對(duì)應(yīng)3個(gè)復(fù)孔，每孔取50μL細(xì)胞液加入96孔板(白板)，再向細(xì)胞中加入50μL熒光素酶底物，工作濃度為0.3mg/mL，避光條件下，將96孔板放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中，孵育5～10min，用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光值。

1.2.6 B16R-FLUC細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的檢測

2 結(jié) 果

2.1 篩選細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)

由于B16R-FLUC細(xì)胞株中含有綠色熒光蛋白，故在熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光，如圖1(封三)。嘌呤霉素篩選及單克隆篩選的細(xì)胞株生長狀態(tài)良好，無污染，陽性細(xì)胞率高，待檢測過表達(dá)Firefly luciferase后，可以大量擴(kuò)增細(xì)胞，凍存細(xì)胞株，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 B16R-FLUC細(xì)胞熒光素酶基因的檢測

篩選的B16R-FLUC細(xì)胞進(jìn)行體外熒光素酶活性的檢測，細(xì)胞濃度按1×106個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL梯度，各取50μL，相對(duì)熒光強(qiáng)度(RLU)分別為2.9×105、2.163×104、1.764×103，顯著高于對(duì)照組B16R細(xì)胞。B16R-FLUC細(xì)胞體外檢測熒光素酶，相對(duì)熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性(R2=0.9996)，可見已經(jīng)獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的黑色素瘤細(xì)胞株。如圖2。

圖2 B16R-FLUC細(xì)胞熒光素酶基因的檢測

2.3 B16R-FLUC細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的檢測及評(píng)估

1×106個(gè)B16R-FLUC細(xì)胞皮下接種C57小鼠，3只C57小鼠成瘤均成功。在接種后的第7d，3只小鼠均長出明顯的腫瘤，用活體成像系統(tǒng)能檢測到腫瘤處較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明表達(dá)熒光素酶基因的B16R-FLUC細(xì)胞能在小鼠中成瘤，并能很好的反應(yīng)腫瘤的生長情況，由此可建立熒光素酶標(biāo)記的小鼠黑色素瘤動(dòng)物模型，為以后黑色素瘤藥物臨床前研究的提供了合適的動(dòng)物模型，見圖3(封三)。

3 討 論

生物發(fā)光成像技術(shù)是近年開發(fā)的一種直接測量活體動(dòng)物中生物發(fā)光信號(hào)的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小動(dòng)物腫瘤模型實(shí)時(shí)連續(xù)性觀察，能夠在整體水平上動(dòng)態(tài)監(jiān)測動(dòng)物中的腫瘤分布、生長情況[4-5]。熒光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光酶的統(tǒng)稱，在熒光素酶中加入對(duì)應(yīng)的熒光素酶底物就可以發(fā)出熒光，而發(fā)出的光可以被光學(xué)顯微鏡探測到[6-7]。根據(jù)這一原理，本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)，將表達(dá)熒光素酶基因的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到B16R細(xì)胞中，經(jīng)過嘌呤霉素的篩選以及體外熒光素酶的鑒定，得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的B16R-FLUC細(xì)胞株，并在C57小鼠皮下植瘤，通過動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測B16R-FLUC細(xì)胞的成瘤性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3只皮下接種B16R-FLUC細(xì)胞的動(dòng)物均能成瘤，成功建立了熒光素酶標(biāo)記C57小鼠皮下移植瘤模型。在抗癌新藥臨床前研究中，熒光素酶標(biāo)記C57小鼠皮下移植瘤模型使腫瘤的生長狀況可以用活體成像系統(tǒng)觀察并進(jìn)行量化，為客觀評(píng)價(jià)抗癌新藥的治療效果提供了新的手段[8-11]。

綜上所述，本研究利用生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的B16R-FLUC細(xì)胞，并成功構(gòu)建適用于小動(dòng)物活體成像觀察的C57小鼠皮下移植瘤模型，不僅為黑色素瘤藥物臨床前的體外殺傷實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)提供了新的實(shí)驗(yàn)手段，而且為客觀性評(píng)價(jià)抗黑色素瘤新藥的治療效果提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。