鞘內(nèi)給藥SRT1720抑制炎癥痛的病理機(jī)制研究*

張 鳳，王煜嘉，謝 敏，朱海麗

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

炎癥痛是一種慢性疾病，主要由組織損傷、化學(xué)刺激或自身免疫引起，其主要特征表現(xiàn)為疼痛超敏、異常性疼痛和自發(fā)性疼痛[1]。盡管疼痛的調(diào)節(jié)涉及多種因素，但脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活被認(rèn)為是維持慢性疼痛的關(guān)鍵因素[2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是數(shù)量最多且分布最廣泛的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，填充于神經(jīng)元之間的空隙并包裹突觸連接，有助于神經(jīng)元回路的建立和重組，調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性，并維持突觸結(jié)構(gòu)[3]。炎癥或組織損傷通過激活脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎癥細(xì)胞因子來參與疼痛的產(chǎn)生和維持，從而增加對(duì)疼痛刺激的敏感性[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰轉(zhuǎn)移酶[5]，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在多種動(dòng)物疼痛模型中發(fā)揮一定的作用，包括炎癥痛、神經(jīng)痛和癌痛[6]。SIRT1激動(dòng)劑處理明顯改善鼠類的行為學(xué)，同時(shí)SIRT1沉默RNA加入可以逆轉(zhuǎn)這種鎮(zhèn)痛效果[7]。SRT1720是選擇性SIRT1激活劑，屬于喹喔啉甲酰胺鹽酸鹽的一種化學(xué)物質(zhì)，分子式為 C25H23N7OS，通過氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合到SIRT1上從而發(fā)揮作用[8]。在本研究中，我們探討鞘內(nèi)注射SRT1720激活SIRT1對(duì)炎癥痛的抑制作用，并研究其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓炎癥的作用，從而為鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物為Sprague-Dawley(SD)大鼠，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國武漢)，體重160～200g，6～8周齡，共18只隨機(jī)分為3組，每組6只。正常對(duì)照組(Control)、模型組(完全弗氏佐劑，CFA)、SRT1720治療組(CFA+SRT1720)。

1.2 主要試劑

SRT1720(Sigma-Aldrich)，加強(qiáng)型RIPA lysis buffer(碧云天)，蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma-Aldrich)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；anti-SIRT1(1∶1000，A0127，ABclonal Technology)，anti-pSer47-SIRT1(1∶1000，PA517391，Thermo Fisher)，anti-GFAP(1∶1000，A19058，ABclonal)，anti-β-actin(1∶5000，A1978，ABclonal)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建大鼠炎癥痛模型

模型組(CFA組)、SRT1720治療組(CFA+SRT1720組)大鼠通過從大鼠左足底注射100μL CFA的方式來建立大鼠慢性炎癥痛模型，正常對(duì)照組(Control組)大鼠足底注射100μL生理鹽水。

1.3.2 鞘內(nèi)注射給藥

將SRT1720治療組大鼠背部剃毛、碘伏消毒后，微量注射器于L5和L6椎骨棘突間隙垂直進(jìn)針，當(dāng)出現(xiàn)空洞感時(shí)證明注射器已進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，此時(shí)將注射器由垂直傾斜至45°緩緩?fù)迫胨幬?，注射完畢后，取出微量注射器，按壓注射部位約1min，以免藥物流出。SRT1720溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，使用前用生理鹽水(1∶1)稀釋。CFA+SRT1720組給藥SRT1720 10μL，濃度為1.0mg/kg，正常對(duì)照組和模型組大鼠注射相等容量的DMSO+生理鹽水。

1.4 檢測方法

1.4.1 50%縮足閾值(PWT)檢測

各組給藥后0、1、3、6和24h，根據(jù)up-down法檢測50%PWT。方法如下：將動(dòng)物放置于行為測試籠內(nèi)，當(dāng)動(dòng)物處于安靜狀態(tài)時(shí)，用Von Frey纖維(0.4～26 g)對(duì)大鼠后足底正中部進(jìn)行垂直剌激，刺激時(shí)纖維稍微彎曲2～3s即可，兩次刺激之間間隔2min。動(dòng)物在受到刺激后，若出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。陽性反應(yīng)時(shí)，用相鄰較低一級(jí)力度纖維進(jìn)行刺激；陰性反應(yīng)時(shí)，用相鄰較高一級(jí)力度纖維進(jìn)行刺激。在出現(xiàn)與前一次測試反應(yīng)不一致結(jié)果時(shí)開始計(jì)數(shù)，記錄6次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測[6]。50%PWT(g)=(10[Xf+Kδ])/10000，Xf為本次行為學(xué)測試中使用的最后一個(gè)Von Frey纖維的階數(shù)，K為痛覺閾矯正系數(shù)(可查表獲得)，δ為相鄰不同纖維刺激之間的差異，即0.224[9]。

1.4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測脊髓組織GFAP、SIRT1、p-SIRT1表達(dá)

大鼠麻醉致死，用眼科剪從中間分離脊柱，使脊髓顯現(xiàn)出來，用解剖剪剝離脊膜，得到完整的脊髓，分離腰段脊髓。使用含有酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿組織，4℃ 10000 rpm離心15min，取上清，加入三分之一體積的4×上樣緩沖液，沸水浴加熱10min，然后用BCA蛋白分析試劑盒確定上清中的蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1h，封閉結(jié)束后用TBS-T洗膜3次，每次5min，然后在4℃條件下Ⅰ抗孵育(GFAP、SIRT1和p-SIRT1)過夜。Ⅰ抗孵育之后，室溫孵育Ⅱ抗1h。洗膜三次后用成像系統(tǒng)掃描觀察，保存掃描圖像并進(jìn)行分析。Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算GFAP、SIRT1、p-SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 ELISA法檢測脊髓組織TNF-α表達(dá)

取各組大鼠腰段脊髓組織，使用含有蛋白酶抑制劑混合物的PBS緩沖液(pH值為7.4)進(jìn)行勻漿，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各100 μl加入孔中，37℃ 90 min。反應(yīng)后棄液，每孔100μL依次加入抗TNF-α抗體工作液，37℃ 60min。洗滌后，每孔加入100μL ABC工作，37℃ 30min。洗滌后，每孔加入90μL TMB顯色液37℃避光反應(yīng)25～30min。每孔100μL依次加入TMB終止液。用酶標(biāo)儀在450nm測定OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SRT1720鞘內(nèi)給藥緩解CFA-炎癥痛模型大鼠痛覺行為

足底注射CFA后，同側(cè)大鼠后爪機(jī)械痛閾值降低(P<0.05)，SRT1720組在給藥后1～24h機(jī)械痛閾值增加(P<0.05)，見表1。同時(shí)對(duì)側(cè)大鼠后爪機(jī)械痛閾值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，見表2。

表1 各組大鼠同側(cè)后爪PWT值比較

表2 各組大鼠對(duì)側(cè)后爪PWT值比較

2.2 SRT1720鞘內(nèi)給藥激活脊髓SIRT1酶活

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示CFA組SIRT1蛋白和磷酸化SIRT1表達(dá)均降低，見表3。SRT1720給藥后CFA大鼠脊髓中均恢復(fù)了SIRT1磷酸化水平，代表SIRT1活性增加(P均<0.05)。

表3 各組脊髓組織p-SIRT1、SIRT1、p-SIRT/SIRT1、GFAP和TNF-α表達(dá)比較

2.3 SRT1720減輕脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并抑制脊髓炎癥

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示CFA組星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)均上調(diào)。SRT1720給藥后降低了GFAP的表達(dá)。同時(shí)采用ELISA法檢測脊髓組織TNF-α表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CFA誘導(dǎo)脊髓TNF-α表達(dá)上升，SRT1720給藥后TNF-α表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)，見表3。

3 討 論

目前構(gòu)建炎癥痛模型的方法主要有四種：直接注入致炎劑造成局部炎癥模型、注入佐劑造成佐劑性關(guān)節(jié)炎、注入Ⅱ型膠原造成關(guān)節(jié)炎和根據(jù)中醫(yī)理論制作的肢體麻痹癥模型。而其中CFA模型是目前認(rèn)為最穩(wěn)定、最理想的炎癥模型。本實(shí)驗(yàn)采用從大鼠足底注入CFA構(gòu)建炎癥痛模型，足底注射CFA誘導(dǎo)脊髓背角(疼痛信息傳遞的重要部分)中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的免疫染色增加，并伴有熱痛覺過敏和機(jī)械性異常性疼痛[10]。本文結(jié)果表現(xiàn)為CFA誘導(dǎo)后同側(cè)大鼠后爪PWT值下降，機(jī)械痛敏增加；同時(shí)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP表達(dá)上調(diào)，表明外周CFA刺激誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活；進(jìn)而，活化的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放促炎細(xì)胞因子來延長并持續(xù)疼痛狀態(tài)[2]。本文也顯示CFA誘導(dǎo)脊髓促炎因子TNF-α的表達(dá)。

SIRT1在DNA損傷修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激和延長細(xì)胞壽命方面起著重要作用[11]。SRT1720是SIRT1的激活劑，已有研究表明它能夠緩解多種代謝性及慢性疾病、治療2型糖尿病、緩解哮喘等[12]。本文發(fā)現(xiàn)CFA誘導(dǎo)脊髓水平SIRT1表達(dá)和酶活均降低。SRT1720鞘內(nèi)給藥后激活SIRT1，并緩解炎癥痛。

綜上，本課題研究發(fā)現(xiàn)SRT1720激活SIRT1減輕脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并緩解炎癥痛，具有重要的臨床意義，為開發(fā)抗炎癥痛藥物提供了理論依據(jù)。