玄駒提取物抗良性前列腺增生作用研究

王勤泉 周超烽 蕭云備 武志剛 魏文揚(yáng) 蔡 健

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（浙江溫州 325000）；2. 杭州施強(qiáng)藥業(yè)有限公司學(xué)術(shù)部（浙江杭州 310053）

前 言

良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）是中老年男性常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究顯示，40 歲以前BPH 發(fā)病率較低，50 歲以后發(fā)病率占40%，80 歲以后發(fā)病率接近90%，而至90 歲時(shí)幾乎100%的中老年男性被發(fā)現(xiàn)存在前列腺增生[1]。但是，關(guān)于BPH 的發(fā)病機(jī)制目前爭(zhēng)議頗多，尚無(wú)一個(gè)理論或假說(shuō)能完全解釋其發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。近年來(lái)，有關(guān)炎癥導(dǎo)致前列腺組織內(nèi)環(huán)境改變及免疫機(jī)制紊亂可能與BPH發(fā)生發(fā)展有關(guān)的理論逐漸成為大家關(guān)注的一個(gè)研究熱點(diǎn)[2-4]。并且，隨著越來(lái)越多的人關(guān)注到前列腺炎癥與前列腺增生的關(guān)系，既往用來(lái)治療前列腺炎的一些藥物逐漸被試用于前列腺增生的治療[5-8]。

復(fù)方玄駒膠囊為一種男科常用中成藥，具有溫腎、壯陽(yáng)、益精、祛風(fēng)濕的功效，因其組方中的君藥玄駒、臣藥淫羊藿、 佐藥蛇床子以及使藥枸杞子四味藥材均具有很好的抗炎作用，而多用于慢性前列腺炎的治療[9-12]。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期臨床研究結(jié)果顯示，復(fù)方玄駒膠囊對(duì)于BPH 也具有一定療效[13]，并且聯(lián)用5a- 還原酶抑制劑和a- 受體阻滯劑后能更好地改善BPH 患者下尿路癥狀[14]。因此，本研究旨在從動(dòng)物水平觀(guān)察其君藥玄駒對(duì)于BPH 的影響并探究其中可能的治療機(jī)制，為復(fù)方玄駒膠囊治療BPH 提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康成年雄性SD 大鼠40 只，體重約200～220g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，均精心飼養(yǎng)在恒溫（21-23℃）、日夜12 小時(shí)循環(huán)交替、飼料和自來(lái)水充足的環(huán)境中。所有的動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作符合《溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心規(guī)章》，動(dòng)物飼養(yǎng)及使用均由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要儀器與試劑

ABI Prism 7500HT 型實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)ABI公司），MICROM HM340E 石蠟切片機(jī)（德國(guó)MICROM公司），PowerPac HC 高電流電源電泳儀和ChemiDoc XRS 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司），OLYMPUS BX60 型熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP405-02），熒光定量PCR 試劑盒 （日本TaKaRa 公司，批號(hào)：RR047B），Bcl-2 特異性單克隆抗體（TDY 公司，批號(hào)：TDY061），Bax 特異性單克隆抗體 （CST 公司，批號(hào)：2772S），HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗 （TDY 公司，批號(hào)：S004），HRP 標(biāo)記山羊抗鼠二抗（TDY 公司，批號(hào)：S001）。

三、實(shí)驗(yàn)藥品

玄駒提取物（懸浮液；批號(hào)：150801）由浙江施強(qiáng)制藥有限公司研發(fā)部提供，密閉儲(chǔ)藏于4℃的冰箱里直至使用。丙酸睪酮 （TP） 注射液 （規(guī)格：25mg/mL，批號(hào)：130614），購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司。非那雄胺片（規(guī)格：5mg，批號(hào)：130614）購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的建立

將40 只大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、非那雄胺組 （Finasteride）、 玄駒組 （XJ） 以及聯(lián)用組（XJ&F），每組8 只。除了對(duì)照組大鼠（僅打開(kāi)陰囊后再縫合）之外，其余大鼠均在完全麻醉下行雙側(cè)睪丸切除術(shù)。手術(shù)一周后，所有的去勢(shì)大鼠均皮下統(tǒng)一注射丙酸睪酮（按5mg/kg/天），而對(duì)照組則皮下注射等量的橄欖油作為對(duì)照，并根據(jù)所對(duì)應(yīng)的分組，所有大鼠每天被予以特定藥物或者生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃4 周。其中，對(duì)照組與模型組均灌生理鹽水（10mL/kg），非那雄胺組灌非那雄胺（5mg/kg)，玄駒組灌玄駒提取物（80mg/kg），聯(lián)用組灌玄駒提取物和非那雄胺 （玄駒提取物80mg/kg，非那雄胺5 mg/kg）。

（二）取材

于末次灌胃24h 之后，將所有的大鼠稱(chēng)重，然后在完全麻醉狀態(tài)下取其前列腺，去除附帶組織，用濾紙吸除前列腺組織表面液體后稱(chēng)重； 取每只大鼠一半的前列腺腹葉組織保存在4%多聚甲醛里，并且以石蠟包埋用于組織學(xué)檢測(cè)，而另一半的前列腺腹葉組織則被保存在-80℃，用于開(kāi)展定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）及蛋白印跡（WB）實(shí)驗(yàn)。

（三）前列腺指數(shù)測(cè)定

各組大鼠前列腺組織稱(chēng)重，記錄數(shù)值，計(jì)算前列腺指數(shù)（PI）。PI=前列腺重量/大鼠體重（mg/g）。

（四）前列腺組織病理形態(tài)觀(guān)察

將固定于4%多聚甲醛的前列腺腹葉組織，經(jīng)梯度洗脫處理后包埋于石蠟中，常規(guī)切片（厚度5μm），蘇木精和伊紅染色（HE）后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察前列腺組織病變情況，并拍照分析結(jié)果。

（五）qPCR 法檢測(cè)前列腺組織中Bax 及Bcl-2 基因mRNA 的表達(dá)

設(shè)計(jì)Bax 和Bcl-2 基因引物序列，見(jiàn)表1。引物合成均由上海生工生物工程有限公司完成。取保存于-80℃的前列腺腹葉組織，采用Trizol 法提取大鼠前列腺組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后利用上述引物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20μL：各0.5μL 上、下游引物，10μL SYBRPremix Ex TaqTMII，7.0μL 雙蒸水，2.0μL 的cDNA 樣本。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，（95℃5s，60℃40s）×45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線(xiàn)，以鑒定PCR 產(chǎn)物的特異性。采集各個(gè)樣本量的Ct 值，用GAPDH 作對(duì)照，以相對(duì)定量ΔΔCt 為方法，按2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物片段

（六）Western blotting 法檢測(cè)前列腺組織中Bax 及Bcl-2 基因蛋白的表達(dá)

取出前列腺組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS) 清洗后吸入EP 管中，加入含有終濃度為1 mM 蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)提取總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定上清中蛋白濃度；按20ug/孔加入待測(cè)樣品進(jìn)行電泳，采用濕法轉(zhuǎn)膜2h，整個(gè)操作過(guò)程中勿產(chǎn)生氣泡；完成后裁剪聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，先用3% 脫脂奶封閉2h，再用洗膜緩沖液（TBST）洗滌5 次（5min/次）后，加入待測(cè)蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后再加熒光二抗，室溫下避光孵育1.5h，用TBST 洗滌5次（5min/ 次），最后采用ChemiDoc XRS 凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參照，蛋白水平結(jié)果以相對(duì)灰度值表示，即目的基因與內(nèi)參灰度測(cè)量的比值。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組數(shù)據(jù)呈方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)，采用獨(dú)立樣本方差分析。以P<0.05 為差異有顯著性，P<0.01 為差異有極顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、玄駒提取物對(duì)模型大鼠PI 的影響

如圖1 所示，相比于對(duì)照組，模型組的PI 值顯著增加（P<0.01），提示前列腺增生大鼠模型造模成功；與模型組比較，非那雄胺組（P<0.01）、玄駒組（P<0.05）以及聯(lián)用組（P<0.01）大鼠的PI 值均明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各組治療均有效果。

注：n=8/組；Control 為 對(duì) 照組，Model 為 模 型組，F(xiàn)inasteride 為非那雄胺組，XJ 為玄駒組，XJ&F 為聯(lián)用組；與對(duì)照組比較：*P<0.01，與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

二、 玄駒提取物對(duì)模型大鼠前列腺病理形態(tài)的影響

圖2 HE 染色結(jié)果顯示，光鏡下對(duì)照組大鼠的前列腺腺體大小基本一致，由單層柱狀上皮細(xì)胞組成的分泌腔有少量嗜酸性分泌物； 而模型組大鼠可見(jiàn)腺體增多且密集，由高柱狀、復(fù)層上皮細(xì)胞組成的分泌腔有大量嗜酸性分泌物； 非那雄胺組在光鏡下可見(jiàn)腺體較多且稍密集，但與模型組相比腺體明顯減少，且上皮細(xì)胞單層柱狀與高柱狀都有； 玄駒組亦可見(jiàn)腺體較多且稍密集，但與模型組比較明顯減少，且上皮細(xì)胞單層柱狀與高柱狀也均有；而聯(lián)用組的情況接近于對(duì)照組，腺體上皮細(xì)胞多為單層柱狀，有少量復(fù)層，分泌物較少，前列腺增生大幅度緩解。

圖2 玄駒提取物對(duì)前列腺增生大鼠病理形態(tài)的影響（HE 染色，×100）

三、玄駒提取物對(duì)模型大鼠前列腺組織內(nèi)Bax/Bcl-2比值的影響

各實(shí)驗(yàn)組前列腺組織中Bax 及Bcl-2 基因的mRNA 及蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4 所示。圖3 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組Bax/Bcl-2 mRNA比值顯著降低（P<0.01），治療4 周后，非那雄胺組、玄駒組以及聯(lián)用組的Bax/Bcl-2 mRNA 比值被顯著升高（P<0.01 或P<0.05），且聯(lián)用組改善最明顯（P<0.01）；由圖4 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，相比于正常組，模型組大鼠前列腺組織內(nèi)Bax 基因蛋白表達(dá)量被顯著抑制，而B(niǎo)cl-2基因的蛋白表達(dá)量被顯著升高（4A），因此模型組大鼠Bax/Bcl-2 蛋白比值顯著降低（4B，P<0.01）；經(jīng)過(guò)治療后發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，非那雄胺組、玄駒組以及聯(lián)用組大鼠Bax 基因的蛋白表達(dá)量得到不同程度的上調(diào)，而B(niǎo)cl-2 基因的蛋白表達(dá)量被不同程度地抑制（4A），進(jìn)而各組大鼠Bax/Bcl-2 蛋白比值得到顯著上調(diào)（4B，P<0.01 或P<0.05），其中聯(lián)用組上調(diào)最明顯（P<0.01）。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺組織中Bax 及Bcl-2 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)比值

圖4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺組織中Bax 及Bcl-2 基因的蛋白相對(duì)表達(dá)及比值

討 論

關(guān)于BPH 的確切發(fā)病機(jī)制目前仍不是很清楚,但一些臨床與實(shí)驗(yàn)觀(guān)察表明，前列腺炎癥與前列腺增生的發(fā)展密切相關(guān)。Nielsen 等通過(guò)病理切片研究發(fā)現(xiàn)，大部分前列腺增生的組織中均有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[15]。此外，一項(xiàng)前列腺藥物治療研究3000 余例的結(jié)果也顯示，前列腺組織中有炎癥改變的患者其前列腺體積較無(wú)炎癥者顯著增大，在其隨訪(fǎng)過(guò)程中合并炎癥者發(fā)生尿潴留的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于無(wú)炎癥改變者[16]。因此，花青素[7]、番茄紅素[8]等具有抑制炎性改變作用的植物制劑，在歐美等國(guó)家被逐漸應(yīng)用于BPH 的治療。在中醫(yī)學(xué)中，專(zhuān)家認(rèn)為BPH 應(yīng)歸屬于“癃閉”范疇，它的主要病機(jī)為“腎氣虧虛、瘀血阻滯”，故在治療上以補(bǔ)腎益氣、活血祛瘀為主[17]。

復(fù)方玄駒膠囊是治療腎陽(yáng)虛常用的中成藥，幾十年來(lái)在臨床上一直用于治療陽(yáng)痿、 男性不育以及慢性前列腺炎等疾病[18-20]。并且，本課題組前期的臨床研究結(jié)果表明，復(fù)方玄駒膠囊對(duì)于BPH 也具有一定療效[13]。玄駒，即擬黑多刺蟻，為復(fù)方玄駒膠囊的君藥，在組方中發(fā)揮著重要作用，可扶正固本、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、養(yǎng)血榮筋、祛瘀通絡(luò)[21]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也顯示玄駒具有提高性能力、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[22]?；诖?，我們推測(cè)玄駒可能在復(fù)方玄駒膠囊治療BPH 中發(fā)揮了主要作用，因而本研究的目的為從動(dòng)物水平上觀(guān)察玄駒對(duì)于前列腺增生的影響并探究其中可能的治療機(jī)制。

本研究采用去勢(shì)術(shù)聯(lián)合丙酸睪酮注射建立前列腺增生模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的前列腺組織異常增大，PI也顯著升高。HE 染色結(jié)果可見(jiàn)模型組大鼠腺體增多且密集，由高柱狀、復(fù)層上皮細(xì)胞組成的分泌腔出現(xiàn)大量嗜酸性分泌物。經(jīng)玄駒提取物及非那雄胺治療后，模型大鼠的PI 顯著降低，顯微鏡下觀(guān)察前列腺腺體明顯減少，前列增生情況得到改善，并且玄駒提取物與非那雄胺聯(lián)用后，對(duì)于PI 以及前列增生的改善更加顯著，與模型組比較具有顯著性差異，這一結(jié)果進(jìn)一步解釋了本實(shí)驗(yàn)室前期復(fù)方玄駒膠囊治療BPH 的研究結(jié)果，表明玄駒可能是復(fù)方玄駒膠囊治療BPH 的主要有效成分，具有明顯抑制前列腺增生的作用。研究表明，天然植物鋸棕櫚漿果提取物可能通過(guò)減少相關(guān)炎性因子IL-12等的分泌，從而抑制前列腺增生[5,6]。那么，或許玄駒對(duì)于前列腺體增生的抑制作用也與其可以明顯抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[23]。

BPH 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未清楚，前列腺上皮和間質(zhì)中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失衡是其中一個(gè)重要機(jī)制[24,25]。研究表明，前列腺組織中細(xì)胞增殖的增加和細(xì)胞凋亡的減少均參與了BPH 的形成過(guò)程，因此二者之間的平衡失調(diào)是引起B(yǎng)PH 發(fā)生的基礎(chǔ)[26]。進(jìn)一步研究前列腺細(xì)胞增殖與凋亡后，發(fā)現(xiàn)前列腺增生標(biāo)本的增殖活性與正常前列腺相比明顯升高，而細(xì)胞凋亡相比于正常前列腺則明顯減少，以上結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞增殖和凋亡共同參與了BPH 的發(fā)生[27]。另有研究表明，細(xì)胞凋亡是一種選擇性的生理死亡，在正常組織中，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡速率是處于平衡狀態(tài)的，如若發(fā)生失衡情況，那么無(wú)論是出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)制速率增加還是細(xì)胞死亡速率減少，均會(huì)造成前列腺細(xì)胞的大量堆積以及前列腺增生[28]。Bax 和Bcl-2 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要基因，其中，Bcl-2 為凋亡抑制基因，抑制細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，研究發(fā)現(xiàn)，人BPH 的組織標(biāo)本中Bcl-2 蛋白的表達(dá)明顯增加，對(duì)前列腺增生有明顯的促進(jìn)作用[29]，而B(niǎo)ax為凋亡促進(jìn)基因，與Bcl-2 凋亡抑制功能相反，二者相互結(jié)合又彼此抑制，因此，Bax/Bcl-2 之間的比例是決定細(xì)胞凋亡強(qiáng)弱的重要環(huán)節(jié)，與前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[30]。本研究qPCR 及WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，玄駒提取物能夠同時(shí)增加在mRNA 及蛋白水平Bax/Bcl-2 的比值，提示玄駒抑制前列腺增生可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2 比值，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。并且，玄駒聯(lián)用非那雄胺后對(duì)于Bax/Bcl-2 比值的上調(diào)作用更加明顯。

綜上所述，本研究首次驗(yàn)證了玄駒提取物具有明顯的抑制前列增生作用，可顯著降低前列腺指數(shù)，抑制前列腺腺體增生，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡基因Bax/Bcl-2 比例平衡，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制前列腺增生，這為以玄駒為君藥的中成藥復(fù)方玄駒膠囊臨床治療BPH 提供了一定理論依據(jù)。并且，本研究還發(fā)現(xiàn)玄駒在聯(lián)用非那雄胺后對(duì)于BPH 的治療效果更加明顯，表明二者聯(lián)用在BPH 的治療中發(fā)揮了協(xié)同增效作用。但是，該研究仍存在一些不足，例如實(shí)驗(yàn)樣本量過(guò)小，并且采用大鼠建立良性前列增生模型是一個(gè)比較快速的過(guò)程（4 周），而人的良性前列增生形成較緩慢，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)存在一定誤差。另外，關(guān)于炎癥與BPH 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及玄駒提取物中發(fā)揮主要作用的具體有效成分確定，我們也將會(huì)在未來(lái)的研究中進(jìn)一步去深入探討。