卵母細(xì)胞的脫顆粒時間對短時受精后胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響*

彭禮繁 張小建 廖梅旭 李曉潔 余 鯤 龍華洋

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心（四川成都 610072）

使用短時受精進(jìn)行體外受精(IVF)時，卵子脫顆粒細(xì)胞時間何時為最佳目前尚存在爭議[1]。脫顆粒細(xì)胞過早可能會增加胚胎的多精受精率，影響胚胎基因表達(dá)與基因甲基化修飾，進(jìn)而影響胚胎質(zhì)量；脫顆粒細(xì)胞時間過晚可能導(dǎo)致少數(shù)患者受精失敗，失去補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射Intracytoplasmic sperm microinjection(ICSI)的最佳時機(jī)。本研究觀察了IVF 去除顆粒細(xì)胞和保留顆粒細(xì)胞發(fā)育的胚胎的發(fā)育參數(shù)，為短時受精及早補(bǔ)救ICSI 周期移植胚胎的選擇提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析了2018年1月～2018年12月在我院行IVF 短時受精第3 天移植的323 例不孕患者的臨床資料?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡25～35 歲；（2）獲卵數(shù)為5～15 枚；（3）病因?yàn)榕讲辉星夷蟹骄赫！⒒颊甙凑章涯讣?xì)胞不同的脫顆粒時間分為A組103 例和B組220 例，A組年齡(33.51±4.34)歲；B組年齡(32.43±4.23)歲。

二、研究方法

1. 促排卵及取卵：選擇本中心常規(guī)的促排卵方案，包括激動劑長方案和拮抗劑方案，使用卵泡刺激素（FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士）進(jìn)行卵巢刺激。當(dāng)有3 個卵泡直徑達(dá)到18～20mm 時注射human choionic gonadotophin (HCG)（艾澤，250μg/ 支，Serono，瑞士）250μg，此后38h 經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

2.受精方法：取卵后3h 左右進(jìn)行雙井皿法授精。內(nèi)井中為1mL 的G-IVF(Vitrolife)，加入10000～20000條精子(精液處理均為密度梯度法)，加入卵子10 枚左右。精卵共孵育3.5h 后用巴氏德吸管隨機(jī)取出5 枚左右卵母細(xì)胞，使用剝卵針(COOK)輕輕吹打去除卵子周圍部分顆粒細(xì)胞，置于新鮮培養(yǎng)液微滴中(G-IVF)中觀察第二極體出現(xiàn)情況；若＞50% 的卵母細(xì)胞出現(xiàn)第二極體則判定受精成功。將剩余的卵母細(xì)胞保留顆粒細(xì)胞從內(nèi)井液滴移出，放入另一新鮮的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)(G-IVF)。受精后20h 后使用剝卵針(COOK)全部去除顆粒細(xì)胞，觀察受精情況，并進(jìn)行原核評分。

3.胚胎的觀察和評估：IVF 后的16～18h (受精后第1 天)觀察卵母細(xì)胞的受精情況，并換液，繼續(xù)用卵裂期培養(yǎng)基培養(yǎng)，第3 天觀察卵裂球的分裂情況，根據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、 細(xì)胞質(zhì)均一性、 碎片多少等進(jìn)行胚胎評分，我們將卵裂球數(shù)目為6 或8，評級為II 的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。在移植日挑選質(zhì)量最好的1～2 枚胚胎進(jìn)行移植，其他胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液（G2，Vitrolife，瑞典） 中繼續(xù)培養(yǎng)。如果移植當(dāng)日因特殊情況不能移植者，將此1～2 枚胚胎冷凍保存或繼續(xù)培養(yǎng)。在受精后第5日或第6日觀察囊胚形成情況，挑選內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量達(dá)到A 或B 級的囊胚進(jìn)行冷凍，C 級的囊胚放棄，滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量不限。

4. 妊娠結(jié)局的判斷及觀察指標(biāo)： 移植后第7日檢測血清HCG 水平，HCG>5U/L 判斷為生化妊娠； 移植后4 周行超聲檢查，超聲下可見胎心及胎囊者判斷為臨床妊娠。種植率＝著床胚胎數(shù)/ 移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率＝臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

5. 分組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)移植胚胎來源分組：A組為移植受精后3h 去除顆粒細(xì)胞的患者，B組為移植受精后3h并在20h 去除顆粒細(xì)胞的患者。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或率(%)表示，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01 為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.患者基本情況比較

兩組患者在年齡、不孕年限、原發(fā)/繼發(fā)比例、促性腺激素用量、促性腺激素使用天數(shù)、獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜上均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.患者的胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較

兩 組 患 者 在MII 卵 數(shù)、2PN 卵 數(shù)、1PN 卵 數(shù)、2PN分裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)等胚胎發(fā)育參數(shù)方面兩組間沒有顯著性差異（P>0.05）；但在3PN 卵數(shù)上兩組間差異極顯著（P<0.01），在種植率和臨床妊娠率上兩組間差異顯著（P<0.05）。結(jié)果見表1。

討 論

卵母細(xì)胞周圍包裹著的大量顆粒細(xì)胞，參與構(gòu)成卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境。兩者為結(jié)構(gòu)和功能上的統(tǒng)一整體，涉及復(fù)雜的雙向信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和分子水平機(jī)制，顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟有重要作用，同時調(diào)控受精及胚胎發(fā)育過程，大量研究表明顆粒細(xì)胞的一些基因能夠預(yù)測胚胎發(fā)育潛能及臨床妊娠結(jié)局[2]。單卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞的Growth differentiation factor-9(GDF-9) 與Bone morphogenetic protein-15(BMP-15)mRNA 能夠評價卵母細(xì)胞的質(zhì)量和預(yù)測卵母細(xì)胞發(fā)育潛能[3]。有研究認(rèn)為[4]將未成熟卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)能夠促使卵子體外成熟，從而增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，改善妊娠結(jié)局，減少周期取消率。有研究結(jié)果[5]表明，將MI 期和GV 期卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后能夠增加總成熟率，MI 期來源獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎率較高，表明顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的核質(zhì)同步化。目前輔助生殖技術(shù)使用控制性超促排卵在非生理狀態(tài)下募集較多的卵泡發(fā)育，可能會影響卵子的質(zhì)量，損害線粒體功能，影響細(xì)胞骨架，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的核質(zhì)發(fā)育不同步，其核的成熟先于質(zhì)的成熟。

表1 兩組患者的臨床資料和胚胎發(fā)育質(zhì)量比較

體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[6]，就人和動物的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂和受精后的發(fā)育潛能而言，有顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞明顯高于無顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞，有較多顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞高于只有少量顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞，這也表明顆粒細(xì)胞能提供卵母細(xì)胞成熟所必需的物質(zhì)，并且這種物質(zhì)依賴于顆粒細(xì)胞包圍卵母細(xì)胞的數(shù)量和范圍。有研究認(rèn)為[7]，顆粒細(xì)胞可以分泌對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì)，如生長因子等；其可作為共培養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)胚胎的發(fā)育；也可以通過代謝去除胚胎體外微環(huán)境中的不利于胚胎發(fā)育的物質(zhì)，如重金屬二價離子等。有研究認(rèn)為[8]，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在的細(xì)胞間復(fù)雜的縫隙連接機(jī)制，對卵泡的發(fā)育及胚胎的質(zhì)量都非常重要。關(guān)于短時受精早去除顆粒細(xì)胞對胚胎基因表達(dá)與甲基化修飾的影響以及顆粒細(xì)胞對胚胎后期發(fā)育潛能和著床率的影響，目前還無定論[9]。

有研究認(rèn)為[10]，常規(guī)IVF 短時受精后6h 通過剝除顆粒細(xì)胞來觀察第二極體是否排出可以預(yù)測卵子受精與否，通過早補(bǔ)救ICSI 可以有效地預(yù)防卵子受精失敗，從而提高臨床妊娠率。有研究認(rèn)為[11]，脫顆粒細(xì)胞的時間過早會導(dǎo)致胚胎的多精受精率比例偏高。其原因可能是：在受精早期，過早脫顆粒細(xì)胞的機(jī)械操作很可能對卵母細(xì)胞外周的透明帶造成損傷，如果造成透明帶上的微小缺口，這會影響卵胞漿內(nèi)的皮質(zhì)反應(yīng)和透明帶反應(yīng)，從而增加多精入卵的機(jī)會；顆粒細(xì)胞上的某些特有成分可以降低多精受精率，如果過早去除顆粒細(xì)胞會使其微環(huán)境發(fā)生改變，也可能增加多精受精的機(jī)會。這與本文的研究結(jié)果一致。此外，在配子形成早期，生殖細(xì)胞被抹除甲基化印跡，在精卵成熟過程中重新甲基化獲得印跡，并被保護(hù)以維持其正確的劑量效應(yīng)。印跡基因的甲基化等表觀遺傳修飾主要發(fā)生于配子發(fā)育階段，而此期恰為短時受精的脫顆粒細(xì)胞時期，過早剝除顆粒細(xì)胞，是否增加對卵母細(xì)胞的額外影響，干擾卵母細(xì)胞或早期胚胎中母親基因印跡的建立和維持，這還有待于進(jìn)一步的研究[12]。

有研究對常規(guī)IVF 與短時受精的胚胎發(fā)育參數(shù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)短時受精不能提高胚胎著床率和臨床妊娠率[13]，另外一些研究的結(jié)論則與之相反[14-15]。本研究比較了短時受精后去除顆粒細(xì)胞與保留顆粒細(xì)胞所發(fā)育的胚胎發(fā)育參數(shù)和妊娠結(jié)局，結(jié)果顯示：移植短時受精后20 h 去除顆粒細(xì)胞發(fā)育的胚胎與短時受精后3h去除顆粒細(xì)胞發(fā)育的胚胎著床率和臨床妊娠率之間有統(tǒng)計學(xué)差異。這也提示了卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞不僅與配子受精有重要關(guān)系，而且對胚胎的后期發(fā)育潛能也具有重要意義，這也為移植時胚胎選擇提供了一個參考指標(biāo).

綜上所述，在短時受精去除顆粒細(xì)胞判斷受精與否時，在確保能夠正確判斷受精的前提下盡可能減少脫顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞數(shù)量。在新鮮移植過程中優(yōu)先選擇移植短時受精3h 并保留顆粒細(xì)胞并在20h 去除顆粒細(xì)胞發(fā)育來胚胎，這有助于提高胚胎的著床率和臨床妊娠率，改善妊娠結(jié)局。