辣木葉多糖的提取及抗氧化活性研究

初雅潔，龔加順

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理671000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一種起源于印度北部的熱帶、亞熱帶多功能植物，常綠或半落葉，廣泛分布在印度，古巴尼日利亞等地，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，被譽(yù)為“奇跡之樹(shù)”和“植物鉆石”。由于辣木具有辛辣味，所以取名為“辣木”，辣木又稱(chēng)為“鼓槌樹(shù)”，是因其樹(shù)干像鼓槌而得名。在中國(guó)臺(tái)灣被稱(chēng)為“21世紀(jì)人體保鏢”[1]，辣木與西洋參、靈芝并稱(chēng)為世界植物三寶。早在數(shù)百年前就有食用辣木的記載。其因特殊的營(yíng)養(yǎng)保健功效成為健康食品界的寵兒，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與“人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)微型寶庫(kù)”的螺旋藻相當(dāng)[2]。每100 g葉粉中的多種礦物質(zhì)、維生素和人體必需氨基酸的含量比世界衛(wèi)生組織推薦的每日攝入標(biāo)準(zhǔn)高[3]。其中辣木葉、莖富含的VC是柑桔的6倍，VA是胡蘿卜的4倍，鈣和蛋白質(zhì)的含量分別是牛奶的4倍和2倍，Mcburney等[4]研究報(bào)道，辣木的鉀含量是香蕉的10倍，鐵是菠菜的4倍，鋅、鎂含量明顯高于其他蔬菜、水果等。與大豆相比，辣木蛋白質(zhì)含量為27%，總氨基酸含量為19.8%。氨基酸種類(lèi)及含量均可與大豆相媲美[5]。聞向東等[6]研究表明每克印度辣木根樣品中的VC含量高達(dá) 10.35 μg/mL，鉀的含量高達(dá) 20.454 μg/g。已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織指定為重要的糧食替代品用于解決欠發(fā)達(dá)地區(qū)的糧食短缺問(wèn)題，向非洲和南美洲等國(guó)家推薦種植。2012年被中國(guó)綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定為“國(guó)家首推綠色食品”，同年被評(píng)為“國(guó)宴特供菜”。

多糖是一種天然活性成分，普遍存在于動(dòng)植物、藻類(lèi)與微生物的細(xì)胞中，多糖存在于植物的根、莖、葉、花、果及種子中。辣木作為一種功能性植物，有著廣闊的開(kāi)發(fā)前景。辣木多糖為辣木中重要有效成分之一，含量豐富，是一種類(lèi)似普洱茶多糖和人參多糖的一種高分子化合物。目前，關(guān)于辣木多糖的研究主要集中在提取工藝和對(duì)辣木多糖含量測(cè)定方面，而對(duì)不同產(chǎn)地辣木多糖的體外抗氧化活性迄今報(bào)道極少。鑒于此，本研究以辣木葉為原料，從提取辣木多糖的方法入手找到最優(yōu)的提取工藝，分析得出6個(gè)不同產(chǎn)地辣木多糖的體外抗氧化活性，為辣木多糖分離純化及其結(jié)構(gòu)測(cè)定的后續(xù)試驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉：普洱市思茅區(qū)、麗江華坪縣、楚雄元謀縣、大理賓川縣、德宏芒市、西雙版納景洪市6個(gè)地方，樣本均取自樹(shù)齡大體相近的辣木，辣木葉經(jīng)干燥過(guò)300目篩，辣木品種為PKM-1改良種多油辣木。蒽酮：BBI Life Sciences；抗壞血酸：上海申博化工有限公司；三氯化鐵：天津市化學(xué)試劑三廠；鐵氰化鉀：中國(guó)成都化學(xué)試劑廠；DPPH：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UN752型可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；RE5210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ALpHA2-4 LD型冷凍干燥器：上?？諝飧稍餀C(jī)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 辣木葉多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

1.3.1.1 辣木葉多糖的提取

辣木粉→70%熱水反復(fù)浸提3次→合并濾液→抽濾→減壓濃縮→石油醚萃取3次→無(wú)水乙醇沉淀→靜置過(guò)夜→離心分離→冷凍干燥→辣木粗多糖

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，確定液料比、提取溫度、提取時(shí)間作為影響多糖提取得率的3個(gè)因素。分別做單因素試驗(yàn)，通過(guò)試驗(yàn)確定對(duì)辣木葉多糖提取得率的影響。

1）液料比對(duì)辣木粗多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取辣木葉粉末2.00 g，固定提取溫度60℃，提取時(shí)間1h，分別考察液料比 10 ∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g），對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響。

2）提取溫度對(duì)辣木粗多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取辣木葉粉末2.00 g，固定液料比20∶1（mL/g），提取時(shí)間 1 h，分別考察提取溫度 40、50、60、70、80、90℃對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響。

3）提取時(shí)間對(duì)辣木粗多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取辣木葉粉末2.00 g，固定液料比20 ∶1（mL/g），提取溫度 70℃，分別考察提取時(shí)間 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響。

1.3.1.3 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到辣木葉粗多糖提取的單因素最佳提取條件。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)，采用三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)各因素做進(jìn)一步優(yōu)化。具體因素水平見(jiàn)表1。

表1 辣木葉多糖提取正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design of Moringa polysaccharides extraction

1.3.1.4 辣木葉粗多糖的得率和提取率的計(jì)算

辣木葉粗多糖得率/%=粗多糖質(zhì)量/辣木粉末質(zhì)量×100

1.3.2 辣木葉多糖體外抗氧化活性研究

采用化學(xué)顯色反應(yīng)結(jié)合分光光度比色法，對(duì)樣品的還原力、清除DPPH自由基、清除羥自由基等抗氧化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以明確各樣品的抗氧化活性情況。以麗江、普洱、大理、德宏、版納、楚雄辣木葉的粗多糖為研究對(duì)象，選取濃度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的多糖溶液，在不同產(chǎn)地和濃度下比較其抗氧化活性。

1.3.2.1 還原力的測(cè)定

分別精確吸取1.0 mL不同濃度的樣品溶液于離心管中，加入磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL，混勻后50℃水浴20 min。取出加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，于4 000 r/min離心機(jī)中離心10 min。取1.0 mL上清液于試管中，加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液。用超純水作參比，在700 nm處[7]測(cè)定混合溶液的吸光值，每個(gè)樣做3次平行。樣品吸光值越大表明還原能力越強(qiáng)。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力

吸取待測(cè)的不同濃度的樣品溶液1.0 mL于10 mL離心管中，加入4.0 mL DPPH甲醇溶液，混勻。室溫25℃下暗處放置10 min，在517 nm處[8-11]測(cè)定吸光值，每個(gè)樣做3次平行，求平均值。計(jì)算方法如下：

1.3.2.3 總抗氧化能力

ABTS+工作液用甲醇稀釋到吸光度為0.7±0.05（吸取1 mL ABTS+工作液加入40 mL乙醇調(diào)制），波長(zhǎng)為734 nm[12]，加100 μL樣品于試管中，再加入3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液，室溫25℃下放置6 min后測(cè)定吸光度，每個(gè)樣做3次平行。計(jì)算方法如下：

式中：A1為100 μL多糖樣品溶液+3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液；A0為3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液。

1.3.2.4 羥自由基清除能力

依次在離心管中加入0.15 mol/L FeSO4和2 mmol/L水楊酸鈉、不同濃度的樣品溶液各1 mL，最后加入6 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃反應(yīng)1 h后，用超純水作參比，在510 nm處[13-14]測(cè)定吸光值，每個(gè)樣做3次平行。吸光值越小，清除羥自由基效果越好。計(jì)算方法如下：

式中：A0為以超純水代替樣品溶液時(shí)測(cè)定的吸光值；A1為加清除劑時(shí)測(cè)定的吸光值；A2為樣品本身的本底值。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉粗多糖的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 液料比對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響

液料比對(duì)辣木葉多糖得率的影響如圖1所示。

液料比低于20∶1（mL/g）時(shí)，辣木葉多糖得率隨液料比的增大呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)較明顯。但當(dāng)液料比到20∶1（mL/g）以后，隨著液料比的增大，辣木葉多糖得率增長(zhǎng)并不明顯。表明液料比在20∶1（mL/g）以前，提取溶劑不足，導(dǎo)致辣木葉多糖得率不高；而液料比達(dá)到20∶1（mL/g）時(shí)，提取溶劑已接近最高值，隨著液料比的增大，對(duì)多糖得率影響不明顯。從提取效率角度來(lái)看，提取溶劑過(guò)多會(huì)給后續(xù)的試驗(yàn)增大工作量，因此，辣木葉粗多糖最適提取液料比應(yīng)控制在20∶1（mL/g）為宜，多糖得率為9.89%。

圖1 液料比對(duì)辣木葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction liquid－solid ratio on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.2 提取溫度對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響

提取溫度對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)辣木葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the Moringa polysaccharide yield rate

提取溫度在70℃之前，隨著溫度的升高，辣木葉多糖得率隨著溫度的升高而增高的趨勢(shì)較顯著，繼續(xù)升高溫度對(duì)提高辣木葉粗多糖得率影響不大。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ臏囟确秶鷥?nèi)，溫度升高，辣木葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞和分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有利于增強(qiáng)傳質(zhì)從而提高辣木葉粗多糖得率；而多糖可溶物在溫度過(guò)高的情況下不穩(wěn)定，其可能會(huì)發(fā)生破壞和分解，造成辣木粗多糖得率下降。因此，辣木葉粗多糖最適提取溫度應(yīng)控制在70℃為宜，多糖得率為10.61%。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)辣木葉多糖得率的影響如圖3所示。

在提取時(shí)間為1.5 h以前，辣木葉多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，隨后趨于平緩最后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樘崛∫欢〞r(shí)間后多糖在提取液中趨于飽和，辣木葉粗多糖得率趨于平衡；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在較高的溫度下，多糖成分也可能被破壞，導(dǎo)致其得率降低。因此，辣木葉粗多糖最適提取時(shí)間應(yīng)選擇在1.5 h為宜，多糖得率為9.68%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)辣木葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了確定各因素對(duì)辣木葉粗多糖得率的影響大小，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳的提取組合，正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)表2的極差分析可知，影響辣木葉多糖提取得率的因素大小順序?yàn)椋築>A>C。根據(jù)直觀分析得出辣木多糖提取的最佳工藝條件為：A2B2C2，即提取溫度為 70 ℃，液料比 20∶1（mL/g），提取時(shí)間為 1.5 h。

2.1.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)正交試驗(yàn)得出辣木葉多糖提取的最佳提取工藝條件為A2B2C2，做3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。得出在此工藝條件下多糖的得率為11.48%，所得結(jié)果高于正交試驗(yàn)組合中的最優(yōu)組合。

表2 辣木葉多糖提取得率正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment for Moringa polysaccharide yield rate

2.2 辣木葉多糖抗氧化活性研究結(jié)果

2.2.1 還原力的測(cè)定

還原能力的大小可以用來(lái)證實(shí)抗氧化活性的強(qiáng)弱，不同產(chǎn)地和濃度的多糖還原力見(jiàn)圖4。

圖4 不同產(chǎn)地和濃度的多糖還原力Fig.4 Different regions and the concentration of polysaccharide reducing power

從圖4中看出，辣木葉多糖相對(duì)于抗壞血酸具有一定的抗氧化活性，不同產(chǎn)地水溶性多糖樣品的吸光值隨著樣品濃度的升高而增大，說(shuō)明還原力隨著濃度的上升而不斷增強(qiáng)，綜合比較得出普洱多糖在6個(gè)樣品中抗氧化活性相對(duì)較強(qiáng)。

2.2.2 DPPH自由基清除

DPPH自由基是一種十分穩(wěn)定的有機(jī)合成自由基，不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖5。

由圖5可知，試驗(yàn)中隨著樣品濃度的升高，DPPH醇溶液特有的紫色在相應(yīng)波長(zhǎng)處的吸光值不斷下降，說(shuō)明清除率隨樣品濃度的增加而增大，綜合比較得出普洱市辣木葉多糖在6個(gè)樣品中DPPH自由基清除能力相對(duì)較強(qiáng)，濃度為5.0 mg/mL時(shí)自由基清除率達(dá)到63.11%。

2.2.3 總抗氧化能力

不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力見(jiàn)圖6。

圖5 不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.5 Different regions and the concentration of polysaccharide DPPH scavenging ability

圖6 不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力Fig.6 Different regions and the concentration of polysaccharide to the ABTS+radical scavenging ability

從圖6中可知，辣木多糖相對(duì)于VC具有一定的抗氧化活性，試驗(yàn)中隨著樣品的加入抑制了ABTS·絡(luò)合物的生成，隨著濃度的升高，綠色的ABTS·絡(luò)合物在相應(yīng)波長(zhǎng)處的吸光值不斷下降，說(shuō)明自由基清除率隨樣品濃度的增加而增大，綜合比較得出普洱多糖在6個(gè)樣品中總抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)，濃度為5.0 mg/mL時(shí)ABTS+自由基清除率達(dá)到46.36%。

2.2.4 羥自由基清除能力

不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)羥自由基清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 不同產(chǎn)地和濃度的多糖對(duì)羥自由基清除能力Fig.7 Different regions and the concentration of polysaccharide of hydroxyl radical scavenging ability

從圖7中發(fā)現(xiàn)，辣木葉多糖相對(duì)于VC具有一定的抗氧化活性，并且對(duì)羥自由基清除率與濃度呈正相關(guān)，綜合比較得出普洱多糖在6個(gè)樣品中羥自由基清除能力相對(duì)較強(qiáng)，濃度為5.0 mg/mL時(shí)羥自由基清除率達(dá)到72.47%。

3 結(jié)論

采用水提醇沉法提取辣木葉多糖，分別考察了液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)辣木葉多糖提取率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化辣木葉多糖的提取工藝技術(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉粗多糖的最佳提取工藝：液料比20∶1（mL/g），提取溫度為 70 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，通過(guò)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得出，在此工藝條件下多糖的得率為11.48%。同時(shí)辣木葉多糖具有一定的體外抗氧化活性，隨著濃度的升高抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，綜合分析6個(gè)不同產(chǎn)地辣木葉多糖的還原力、DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力、羥基自由基清除能力，以普洱市辣木葉多糖的體外抗氧化活性最佳，其它各產(chǎn)地辣木葉多糖葉也具有一定的抗氧化活性。為各地辣木種植和特色產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了一定的指導(dǎo)依據(jù)。