貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠的治療效果及對(duì)癌組織S100A4和MMP-9的影響

毛衛(wèi)波，朱憶凌，嚴(yán)禮平，周佳慧，黃淵，陳國(guó)榮

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 麗水市中心醫(yī)院 病理科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015）

大部分肺癌患者在診斷時(shí)已屬于中晚期，1年生存率極低，且發(fā)病率逐年上升[1]。目前臨床上治療肺癌的方式主要為化療、放療和手術(shù)治療，但化療放療的不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，手術(shù)治療也只適用于肺癌早期患者，因此篩選出不良反應(yīng)小，抗癌效應(yīng)強(qiáng)的藥物是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。紫杉醇可從短葉紫衫樹皮中提取，對(duì)Leweis肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[2]。有研究表明，紫杉醇抗血管生成能力較強(qiáng)，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，進(jìn)而間接抑制腫瘤細(xì)胞血管的形成[3]。但紫杉醇本身具有一定的細(xì)胞毒性，因此，尋找能提高紫杉醇療效的抗腫瘤藥物是當(dāng)前治療肺癌的重要方向。貝伐單抗作為一種重組的人源化單克隆抗體，也能與VEGF結(jié)合并阻斷其生物活性，從而有效地抑制腫瘤血管生成[4-5]，本研究擬分析兩者結(jié)合應(yīng)用的抗腫瘤效果是否能優(yōu)于單味藥。S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9蛋白都參與了腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的過程，它們表達(dá)水平的變化對(duì)于監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展具有指導(dǎo)意義。本研究通過對(duì)腫瘤細(xì)胞VEGF和相關(guān)蛋白表達(dá)的變化來闡述貝伐單抗結(jié)合紫杉醇的抗癌效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：鼠源性Leweis肺癌瘤株，由國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證：SCXK（浙）2016-0010。

1.1.3 藥品與主要試劑：紫杉醇，規(guī)格：30 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H20053837（合肥大東方藥業(yè)有限責(zé)任公司）；貝伐單抗，規(guī)格：100 mg/支，批號(hào)：B6003B02（上海羅氏制藥有限公司）；IL-2、IL-6、TNF-α和VEGF的ELISA試劑盒，均購自南京建成生物有限公司；S100A4和MMP-9的ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；S100A4和MMP-9試劑盒購于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.4 主要儀器：7600全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）、3K15超低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰儀器公司）、 CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司）

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模：將Leweis肺癌細(xì)胞在37 ℃下快速解凍，復(fù)蘇后的細(xì)胞采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至正常狀態(tài)下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞接種于小鼠右腋下，21 d后，對(duì)狀態(tài)較好的小鼠脫頸椎處死，取出生長(zhǎng)完整的瘤組織，將其包膜剔除，制成癌細(xì)胞懸液后，分別取0.2 mL接種于小鼠右腋下（細(xì)胞數(shù)目：2×106/只）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法：將實(shí)驗(yàn)小鼠分為正常組（未接種瘤液）、模型組（接種瘤液）、貝伐單抗組（接種瘤液）、紫杉醇組（接種瘤液）、聯(lián)合組（接種瘤液），每組8只。正常組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.4 mL/只，每周2次；貝伐單抗組腹腔注射15 mg/kg貝伐單抗，每周2次；紫杉醇組腹腔注射10 mg/kg紫杉醇，每周2次；聯(lián)合組分別腹腔注射15 mg/kg貝伐單抗和10 mg/kg紫杉醇，每周2次。所有小鼠給藥2周。

1.2.3 瘤重與抑瘤率：給藥2周后，處死小鼠，取出腫瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重× 100%。

1.2.4 ELISA法測(cè)定IL-2、IL-6及TNF-α的含量：給藥2周后，小鼠摘眼球取血2～3 mL，靜置2～3 h后，以3 000 r/min離心10 min，取血清。ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、IL-6及TNF-α的含量。

1.2.5 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群：同上得血清，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清中CD3+、CD4+、CD8+的比例，并計(jì)算CD4/CD8比值。

1.2.6 ELISA法和Western blot法測(cè)定VEGF含量及蛋白表達(dá)水平：同上得血清，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測(cè)血清中VEGF含量。取出的腫瘤組織，定量稱取做組織勻漿，用Western blot法檢測(cè)其中VEGF表達(dá)水平。

1.2.7 ELISA法測(cè)定腫瘤組織中S100A4與MMP-9表達(dá)水平：同上的組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測(cè)組織中S100A4與MMP-9含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠瘤重以及抑瘤率的影響 連續(xù)給藥2周后，貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯(lián)合組的瘤重顯著低于模型組（P＜0.05），且紫杉醇組、聯(lián)合組的瘤重顯著低于貝伐單抗組（P＜0.05）；聯(lián)合組抑瘤率明顯高于貝伐單抗組和紫杉醇組（P＜0.05），紫杉醇組抑瘤率明顯高于貝伐單抗組（P＜0.05）。見表1。

表1 5組小鼠瘤重、抑瘤率的比較（每組n=8， ）

表1 5組小鼠瘤重、抑瘤率的比較（每組n=8， ）

與模型組比：aP＜0.05；與貝伐單抗組比：bP＜0.05；與紫杉醇組比：cP＜0.05

組別 瘤重（g） 抑瘤率（%）正常組 - -模型組 7.48±0.66 -貝伐單抗組 4.12±0.86a47.25±4.54紫杉醇組 3.13±0.34ab73.02±6.98b聯(lián)合組 0.99±0.28abc88.12±9.08bcF12.343 243.432P＜0.001 ＜0.001

2.2 貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠血清中IL-2、IL-6及TNF-α含量的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合組小鼠血清中的IL-2、IL-6及TNF-α含量與正常組比較升高（P＜0.05）；貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯(lián)合組的上述指標(biāo)含量顯著低于模型組（P＜0.05）；同時(shí)紫杉醇組以及聯(lián)合組的上述指標(biāo)含量明顯低于貝伐單抗組（P＜0.05）；紫杉醇組血清IL-2和IL-6含量明顯高于聯(lián)合組（P＜0.05），而紫杉醇組血清TNF-α含量明顯低于聯(lián)合組（P＜0.05），見表2。

表2 5組小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比較（每組n=8， ，pg/mL）

表2 5組小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比較（每組n=8， ，pg/mL）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 IL-2 IL-6 TNF-α正常組 110.43±11.21 33.02±4.89 98.02± 4.89模型組 265.48±14.66a75.06±6.88a300.06±26.88a貝伐單抗組 206.12±12.86ab51.25±5.54ab262.25±20.54ab紫杉醇組 198.13±12.34abc45.02±3.98abc117.02±20.98abc聯(lián)合組 120.99±13.28abcd37.12±4.08abcd152.12±26.08abcdF132.234 104.561 201.232P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合組小鼠血清中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8的水平與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯(lián)合組的上述指標(biāo)含量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫杉醇組及聯(lián)合組的上述指標(biāo)含量與貝伐單抗組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫杉醇組與聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠VEGF含量及蛋白表達(dá)水平的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合組小鼠血清VEGF含量以及癌組織VEGF蛋白表達(dá)水平與正常組比升高（P＜0.05）；給藥2周后，貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯(lián)合組的上述指標(biāo)與模型組降低（P＜0.05）；紫杉醇組及聯(lián)合組的上述指標(biāo)與貝伐單抗組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫杉醇組與聯(lián)合組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 5組小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比較（每組n=8， ）

表3 5組小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比較（每組n=8， ）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4/CD8正常組 66.43±6.21 42.02±4.89 23.02±3.89 1.72±0.29模型組 38.48±4.66a25.06±3.88a32.06±3.88a0.86±0.18a貝伐單抗組 50.12±3.86ab34.25±4.54ab25.25±3.54ab1.25±0.34ab紫杉醇組 21.13±3.34abc20.02±3.98abc38.02±3.98abc0.52±0.18abc聯(lián)合組 43.99±3.28abcd30.12±3.08abcd28.12±4.08abcd1.02±0.08abcdF33.234 45.432 234.453 23.222P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 5組小鼠VEGF含量和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（每組n=8，）

表4 5組小鼠VEGF含量和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（每組n=8，）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 含量（pg/mL） 蛋白相對(duì)表達(dá)水平正常組 10.43±1.21 0.35±0.11模型組 33.48±4.66a0.97±0.16a貝伐單抗組 23.12±2.86ab0.60±0.16ab紫杉醇組 28.13±3.34abc0.71±0.14abc聯(lián)合組 20.99±2.28abcd0.44±0.11abcdF342.123 123.342P＜0.001 ＜0.001

2.5 貝伐單抗結(jié)合紫杉醇對(duì)肺癌小鼠S100A4與MMP-9含量的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合組小鼠癌組織中S100A4與MMP-9含量顯著高 于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，貝伐單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合組小鼠癌組織中S100A4、MMP-9的含量顯著降低（P＜0.05）；紫杉醇組及聯(lián)合組S100A4、 MMP-9含量較貝伐單抗組降低（P＜0.05）；與紫杉醇組比較，聯(lián)合組小鼠癌組織中S100A4與MMP-9含量顯著減少（P＜0.05）。見表5。

表5 5組小鼠S100A4、與MMP-9含量比較（每組n=8， ，pg/mL）

表5 5組小鼠S100A4、與MMP-9含量比較（每組n=8， ，pg/mL）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 S100A4 MMP-9正常組 926.02±105.78 17.02±1.89模型組 2 836.06±199.34a47.06±6.88a貝伐單抗組 2 288.25±421.83ab40.25±8.54ab紫杉醇組 1 933.02± 3.98abc37.02±4.98abc聯(lián)合組 1 508.12±116.90abcd32.12±6.08abcdF336.339 112.398P＜0.001 ＜0.001

3 討論

抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用是當(dāng)前最主要的腫瘤治療方式?；熓悄壳芭R床治療肺癌的主要治療手段，充分了解化療藥物的藥理機(jī)制對(duì)臨床合理應(yīng)用具有重要參考價(jià)值。目前貝伐單抗聯(lián)合紫杉醇是臨床上治療非鱗非小細(xì)胞肺癌的常用方案。本研究結(jié)果顯示，貝伐單抗聯(lián)合紫杉醇能顯著降低小鼠的瘤重，提高抑瘤率。貝伐單抗能特異性地結(jié)合VEGF，影響腫瘤血管的形成，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)紫杉醇的作用靶點(diǎn)在微管蛋白，其能抑制微管的有絲分裂從而使癌細(xì)胞凋亡壞死。兩者在抗腫瘤的形成與發(fā)展中起協(xié)同作用。

IL-2和IL-6是在炎癥反應(yīng)中起重要的細(xì)胞因子，其能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)多種殺傷細(xì)胞的分化，還能誘導(dǎo)TNF-α、IFN-λ等炎癥反應(yīng)因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，研究證明貝伐單抗能顯著降低腫瘤小鼠體內(nèi)炎性因子的水平，改善小鼠免疫能力[6-7]。而過量的TNF-α與受體結(jié)合后能激活細(xì)胞核因子以及調(diào)控細(xì)胞間信息的激酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。有研究證明，抑制TNF-α表達(dá)，能夠改善機(jī)體的代謝，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[8]。本研究也驗(yàn)證了貝伐單抗結(jié)合紫杉醇能顯著降低肺癌小鼠TNF-α、IL-2和IL-6水平，同時(shí)改善小鼠細(xì)胞免疫能力（CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8）。進(jìn)一步說明兩種藥物的聯(lián)合使用能更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散，減輕小鼠體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷，一定程度上提高了細(xì)胞因子的分泌水平，促進(jìn)了免疫功能的恢復(fù)。同時(shí)腫瘤的形成及生長(zhǎng)需要新生血管來為其提供生存所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9-11]。VEGF能夠增加血管滲透性導(dǎo)致蛋白沉積，從而促進(jìn)了血管的生成。有研究報(bào)道腫瘤血管的抑制會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死，并證明紫杉醇的抗腫瘤作用與其能抑制血管生成有關(guān)[12]。貝伐單抗作為一種重組的人源化單克隆抗體，也能與VEGF結(jié)合并阻斷其生物活性，從而使腫瘤血管形成受到阻礙，導(dǎo)致腫瘤組織萎縮。本研究結(jié)果表明，貝伐單抗組和紫杉醇組均能顯著降低肺癌小鼠血清中VEGF的含量，但聯(lián)合組的效果最好。其原因分析主要是貝伐單抗作為血管生成抑制劑，能夠誘導(dǎo)腫瘤血管的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，使其失去腫瘤血管的病理特征，并趨向于正常化，從而改善了腫瘤微環(huán)境，同時(shí)聯(lián)合紫杉醇，能夠增加滲透到腫瘤內(nèi)的藥物量，提高化療的效果。

MMP-9是鋅金屬蛋白酶超家族重要的一員，屬于明膠酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)。研究證明[13]，MMP-9通過分解正常細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，使癌細(xì)胞能夠進(jìn)入血液，參與循環(huán)，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。MMP-9也參與腫瘤血管形成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的能力[14]。S100A4是重要的功能蛋白，它主要介導(dǎo)了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌和細(xì)胞的增殖分化。有研究表明S100A4參與腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移過程[15-16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠癌組織中的S100A4與MMP-9的含量明顯高于貝伐單抗組和紫杉醇組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)相比于紫杉醇組和貝伐單抗組，聯(lián)合組更能顯著降低C57BL/6小鼠肺癌組織中S100A4與MMP-9含量。由于在抗腫瘤治療過程中，單一的給藥治療容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，而貝伐單抗與紫杉醇具有協(xié)同效應(yīng)，能進(jìn)一步增加了抗腫瘤的效果。巨噬細(xì)胞釋放大量的MMP-9蛋白，以及S100A4蛋白的過量表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲，而貝伐單抗結(jié)合紫杉醇能增強(qiáng)紫杉醇對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力，提高機(jī)體的免疫能力，從而降低MMP-9以及S100A4蛋白的表達(dá)。

綜上所述，貝伐單抗結(jié)合紫杉醇治療能夠增強(qiáng)抗腫瘤的效果，降低腫瘤小鼠血清中VEGF的含量以及肺癌組織中S100A4與MMP-9含量，但其對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制的作用、抗癌基因的作用還需要進(jìn)一步闡明。