模型化合物誘導(dǎo)木質(zhì)素降解菌株煙曲霉Aspergillus fumigatus G-13的產(chǎn)酶特性

馮茜 燕紅

摘要：以木質(zhì)素酶活力作為指標(biāo)，采用阿魏酸、對香豆酸和芥子酸3種模型化合物作為底物，通過添加纖維素及葡萄糖并改變培養(yǎng)方式，研究A。Fumigatus G-13誘導(dǎo)產(chǎn)酶特性。結(jié)果表明，搖床培養(yǎng)較靜置培養(yǎng)菌株產(chǎn)酶能力提高了2-5倍;單獨采用木質(zhì)素模型化合物作為誘導(dǎo)物，芥子酸誘導(dǎo)作用最強，其LiP、Iac和MnP最大酶活分別可達(dá)24.08、21.67、110.78U/L;羧甲基纖維素、微晶纖維素和葡萄糖作為共底物，均對3種模型化合物對菌株的誘導(dǎo)能力起促進(jìn)作用，其中葡萄糖的促進(jìn)作用最為明顯（較原酶活提高約1.38-5.34倍），羧甲基纖維素的促進(jìn)效果優(yōu)于微晶纖維素;且纖維素模型化合物和葡萄糖在誘導(dǎo)產(chǎn)酶方面起協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素模型化合物;誘導(dǎo)產(chǎn)酶;木質(zhì)素酶;煙曲霉菌

DOI：10.15938/j.jhust.2020.02.021

中圖分類號：O643.3;Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2683（2020）02-0156-10

0 引言

木質(zhì)纖維素具有來源豐富、數(shù)量多、價格低廉等優(yōu)勢。對解決當(dāng)前人類所面臨的資源短缺、環(huán)境污染等問題具有重大意義，但是木質(zhì)素的天然結(jié)構(gòu)極大地阻礙了其資源化利用與無害化處理。同時，就木質(zhì)素生物降解機理而言，由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其代謝途徑、降解機制和相關(guān)酶酶學(xué)性質(zhì)均尚未完全闡明，而木質(zhì)素模型化合物因其簡便易得、可有效代表天然木質(zhì)素的典型結(jié)構(gòu)和常作為木質(zhì)素降解的中間代謝產(chǎn)物等特點，對木質(zhì)素生物降解的研究及降解機理的揭示具有一定的理論意義。因此，化學(xué)結(jié)構(gòu)已知的低分子量的簡單木質(zhì)素模型化合物（包括單體模型化合物、二聚體和三聚體等）和木質(zhì)素改性化合物引起了世界范圍內(nèi)學(xué)者及研究機構(gòu)的重視。陳紅歌等發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解模式微生物黃孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium）對木質(zhì)素模型化合物阿魏酸有很好的降解作用，該菌與阿魏酸共培養(yǎng)2d后降解率可達(dá)99%以上。而張歡的研究表明，貪銅菌B-8（cupfiavidus B-8）在6d后對芥子酸的降解率可達(dá)到98.13%。但是，對采用纖維素模型化合物及葡萄糖作為共底物誘導(dǎo)微生物利用木質(zhì)素模型化合物產(chǎn)木質(zhì)素酶的報道極少，而常見天然木質(zhì)纖維素，如水稻秸稈纖維素的含量高達(dá)51.6%。因此，本研究將3種木質(zhì)素單體模型化合物阿魏酸、對香豆酸和芥子酸用于木質(zhì)素生物降解的研究，以A。Fumigatus G-13為研究對象，檢測以木質(zhì)素模型化合物、纖維素共底物和葡萄糖為誘導(dǎo)底物得到的粗酶液的木質(zhì)素酶活水平，分析比較木質(zhì)素模型化合物種類、纖維素模型化合物種類及葡萄糖對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)作用，為該菌株木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生以及生物降解木質(zhì)素的機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

可降解木質(zhì)素的A。Fumigatus G-13，由實驗室前期分離篩選并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，瓊脂20g/L，微量VB₁，加蒸餾水配成1000mL，自然pH值，120℃滅菌20min。

1.1.3 試劑配制

（1）大量元素營養(yǎng)鹽溶液：KH₂PO₄0.2150g，（NH₄）₂SO₄0.2160g，MgSO₄·7H₂O 0.0073g，CaCl₂0.0150g溶解并定容至100mL，自然pH值。

（2）微量元素的營養(yǎng)鹽溶液：CoCl₂·6H₂O 3.9g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4g/L，MnSO₄·H₂O 1.6g/L與FeSO₄·7H₂O 5g/L，溶解并定容至1000mL，自然pH值。

1.1.4試驗儀器及設(shè)備

TYXQ-LS-75S型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）、SW-CJ-1FD潔凈臺（上海博訊實業(yè)有限公司）、GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）、XSP-2CA光學(xué)顯微鏡（上海辰華）、SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司）、SHZ-A水浴恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司）、電子分析天平（常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）、離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將保藏于4℃的A。Fumigatus G-13PDA培養(yǎng)基斜面取出，用無菌水將真菌斜面孢子沖下，制成10⁶個/mL（血球計數(shù)法測定）孢子懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2試駿設(shè)計

樣品編號對應(yīng)的底物成分及培養(yǎng)方式見表l。木質(zhì)素模型化合物分別為阿魏酸、對香豆酸和芥子酸，纖維素共底物為微晶纖維素和羧甲基纖維素。試驗組1～6為靜置培養(yǎng)方式，其中實驗組1用于比較分析各木質(zhì)素模型化合物對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)作用;實驗組2和3分別用于分析纖維素模型化合物微晶纖維素和羧甲基纖維素對各木質(zhì)素模型化合物對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)促進(jìn)作用;實驗組4用于分析葡萄糖對各木質(zhì)素模型化合物對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)促進(jìn)作;實驗組5和6分別用于分析同時添加纖維素模型化合物微晶纖維素或羧甲基纖維素及葡萄糖對各木質(zhì)素模型化合物對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)促進(jìn)作。實驗組7～12采用搖瓶培養(yǎng)方式，依次分別相對于實驗組1-6對比分析培養(yǎng)方式對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶作用。本研究采用液體培養(yǎng)，于250mL錐形瓶中加人大量元素營養(yǎng)鹽溶液100mL和微量元素營養(yǎng)鹽溶液0.1mL，木質(zhì)素單體模型化合物濃度為0.1mmol/L，纖維素共底物和葡萄糖濃度均為10s/L，于120℃高壓滅菌20min。后接人孢子懸液4mL，于30℃下進(jìn)行培養(yǎng)，采用搖瓶培養(yǎng)時，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，分別于培養(yǎng)第3、6、9、12、15d取樣進(jìn)行酶活測定。每組3個平行樣。

由此可知，添加微晶纖維素作為輔助碳源，會促進(jìn)阿魏酸和芥子酸誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶，但是會抑制以對香豆酸為誘導(dǎo)物G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶。

2.3 木質(zhì)素模型化合物聯(lián)合羧甲基纖維素誘導(dǎo)

A.Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶特性研究

圖3（a）、3（b）和3（c）分別為阿魏酸+羧甲基纖維素、對香豆酸+羧甲基纖維素和芥子酸+羧甲基纖維素為底物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和錳過氧化物酶活性在靜置及搖瓶培養(yǎng)條件下隨時間的變化曲線。在靜置條件下，與僅以木質(zhì)素模型化合物為底物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)酶相比，添加羧甲基纖維素對酶活變化的趨勢影響也很小，達(dá)到最大酶活時間不變。但酶活性會受羧甲基纖維素的添加所影響，以阿魏酸+微晶纖維素為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為24.13、15.09、123.98U/L;對香豆酸+微晶纖維素為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為21.66、14.18、121.89U/L;以芥子酸+微晶纖維素為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為31.22、31.05、187.43U/L。

在搖瓶培養(yǎng)條件下，酶活變化趨勢與靜置條件下相似，添加羧甲基纖維素使A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶能力不僅分別較僅以木質(zhì)素模型化合物有所提高，而且較添加微晶纖維素也有所提高。由此可知，添加纖維素模型化合物作為輔助碳源，會促進(jìn)3種模型化合物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶，且羧甲基纖維素的促進(jìn)作用更為明顯。

2.4 木質(zhì)素模型化合物聯(lián)合葡萄糖誘導(dǎo)

A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶特性研究

圖4（a）、4（b）和4（c）分別為阿魏酸+葡萄糖、對香豆酸+葡萄糖和芥子酸+葡萄糖為底物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和錳過氧化物酶活性在靜置及搖床培養(yǎng)條件下隨時間的變化曲線。在靜置條件下，添加葡萄糖作為輔助碳源與木質(zhì)素模型化合物共同誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)酶時，酶活趨勢保持不變，但是其誘導(dǎo)作用強于添加纖維素模型化合物。以阿魏酸+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為27.91、19.14、139.04U/L;對香豆酸+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為22.58、15.86、127.67U/L;以芥子酸+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為30.13、30.52、189.07U/L。

在搖瓶培養(yǎng)條件下，添加葡萄糖作為輔助碳源時，相較于樣品僅以木質(zhì)素模型化合物為誘導(dǎo)物，其酶活提高了3～5倍。具體來說：阿魏酸添加葡萄糖為底物的A。Fumigatus G-13液態(tài)發(fā)酵，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為不添加葡萄糖（即A-7組）所產(chǎn)酶活的3.75、3.98、3.21倍;對香豆酸添加葡萄糖為底物的A。Fumigatus G-13液態(tài)發(fā)酵，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別增長為B-7組酶活的3.97、4.05、3.91倍;而芥子酸添加葡萄糖則LiP、Lac和MnP活性分別為C-7組的2.20、3.84、4.28倍。且根據(jù)結(jié)果可知，在發(fā)酵的前6d，A-10、B-10和C-IO的酶活分別明顯高于A-7、B-7和C-7，其可能的原因是葡萄糖的存在為菌株A。Fumigatus G-13發(fā)酵提供了易代謝碳源，使菌株能夠在培養(yǎng)初期即可大量快速生長繁殖。燕紅和袁俊超等人的研究表明，以葡萄糖為碳源時菌株能夠產(chǎn)木質(zhì)素降解酶，而同時添加葡萄糖和其他木質(zhì)纖維素時，A。Fumigatus YS。ITBI產(chǎn)木質(zhì)素酶能力提升顯著。

通過對比可知，添加葡萄糖作為輔助碳源相比于添加纖維素模型化合物，對菌株產(chǎn)酶的促進(jìn)作用更為明顯（提高了約1.38～5.34倍）。同時，發(fā)現(xiàn)以芥子酸+葡萄糖為底物的A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力在搖床培養(yǎng)條件下顯著提高，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為在相同底物條件下靜置培養(yǎng)的1.11、1.47、1.41倍。比較添加葡萄糖和添加纖維素模型化合物為輔助碳源可知，添加葡萄糖作為輔助碳源，對于3種木質(zhì)素模型化合物其對菌株產(chǎn)木質(zhì)素酶的促進(jìn)效果均好于纖維素模型化合物。其原因可能是葡萄糖的添加會大量刺激菌絲體生長，進(jìn)而促進(jìn)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素降解酶。

2.5 木質(zhì)素模型化合物聯(lián)合微晶纖維素及葡萄糖

誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶特性研究

圖5（a）、5（b）和5（c）分別為在靜置或搖瓶培養(yǎng)條件下，木質(zhì)素模型化合物阿魏酸+微晶纖維素+葡萄糖、對香豆酸+微晶纖維素+葡萄糖和芥子酸+微晶纖維素+葡萄糖為底物誘導(dǎo)A。FumigatusG-13產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和錳過氧化物酶活性隨時間的變化曲線。在靜置培養(yǎng)下，添加葡萄糖及微晶纖維素作為輔助碳源與木質(zhì)素模型化合物共同誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)酶時，酶活變化顯著，其誘導(dǎo)作用明顯強于單獨添加葡萄糖或微晶纖維素。以阿魏酸+微晶纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為36.38、25.90、171.23U/L;對香豆酸+微晶纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為24.06、19.26、137.69U/L;以芥子酸+微晶纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為47.46、48.45、265.40U/L。

在搖瓶培養(yǎng)條件下，3種誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下A.Fumigatus G-13產(chǎn)LiP、Lac和MnP分別為相應(yīng)底物條件下靜置培養(yǎng)酶活的約1.9、2.1、2.6倍。對比同時添加葡萄糖及微晶纖維素和單獨添加兩者發(fā)現(xiàn)，其對A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)作用較兩者的直接疊加增大約1.12（LiP）、1.34（Lac）、1.16（MnP）倍。結(jié)果表明，葡萄糖與微晶纖維素在影響木質(zhì)素模型化合物產(chǎn)酶方面起協(xié)同作用。雖然馬澤林等人在提高木質(zhì)素生物降解方法的研究中表明，微生物對復(fù)雜碳源具有選擇性利用的特質(zhì)，但在本研究中該濃度下的輔助碳源和微晶纖維素的添加起協(xié)同作用而非碳代謝抑制（CCR）。

2.6 木質(zhì)素模型化合物聯(lián)合羧甲基纖維素及葡萄

糖誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶特性研究

圖6（a）、6（b）和6（c）分別為在靜置或搖瓶培養(yǎng)條件下，木質(zhì)素模型化合物阿魏酸+羧甲基纖維素+葡萄糖、對香豆酸+羧甲基纖維素+葡萄糖和芥子酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為底物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和錳過氧化物酶活性隨時間的變化曲線。靜置培養(yǎng)條件下，添加葡萄糖及羧甲基纖維素作為輔助碳源與木質(zhì)素模型化合物共同誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)酶時，酶活變化更為顯著，其誘導(dǎo)作用也強于單獨添加葡萄糖或羧甲基纖維素。以阿魏酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為44.68、29.61、139.58U/L;對香豆酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為29.18、22.51、126.33U/L;以芥子酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別為56.91、51.86、277.18U/L。

在搖瓶培養(yǎng)條件下，以阿魏酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別增長為同誘導(dǎo)物靜置培養(yǎng)條件下的1.93、1.83、3.09倍;對香豆酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別增長為同誘導(dǎo)物靜置培養(yǎng)條件下的2.63、2.45、3.47倍;以芥子酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分別增長為同誘導(dǎo)物靜置培養(yǎng)條件下的2.34、2.11、1.97倍。而以芥子酸+羧甲基纖維素+葡萄糖為誘導(dǎo)物在搖床培養(yǎng)條件下，木質(zhì)素模型化合物對菌株A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的誘導(dǎo)能力最強，為133.17（9d）、109.61（12d）、548.71（12d）U/L，結(jié)果表明，葡萄糖與羧甲基纖維素在影響木質(zhì)素模型化合物產(chǎn)酶方面起協(xié)同作用，而且其作用強于相應(yīng)以葡萄糖和微晶纖維素為補充物的菌株產(chǎn)酶（誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力增強約1.12-1.25倍（LiP）、1.02～1.30倍（Lac）和0.91～1.24倍（MnP）），這一結(jié)果與張佩佩利用細(xì)菌絲狀叢毛單胞菌C35（Comamonas serinivorans C35）降解木質(zhì)素模型化合物的研究相一致。

綜上，添加葡萄糖或者纖維素模型化合物會對木質(zhì)素模型化合物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶產(chǎn)生影響，這2類物質(zhì)的添加會對阿魏酸和芥子酸誘導(dǎo)產(chǎn)酶起促進(jìn)作用，但是單獨微晶纖維素添加作為補充碳源時，會抑制對香豆酸誘導(dǎo)A。FumigatusG-13產(chǎn)木質(zhì)素酶。同時，輔助碳源的添加并不會改變模型化合物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的酶活趨勢，也不會對三者誘導(dǎo)菌株降解木質(zhì)素的能力產(chǎn)生顛覆性改變。張年磊的研究也印證了這一觀點，即添加輔助碳源會對曲霉菌F-1（Aspergillus Sp。F-1）產(chǎn)木質(zhì)素酶的活性產(chǎn)生影響但種類不會改變。即不論添加何種輔助碳源，就最大酶活而言，芥子酸誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的能力強于阿魏酸強于對香豆酸。就3種木質(zhì)素降解酶而言，輔助碳源的添加對Lac的影響最大，最大酶活提升至與Lip相當(dāng)?shù)乃缴踔谅愿哂贚ip，但是僅以木質(zhì)素模型化合物作為誘導(dǎo)物時，Lac大小僅相當(dāng)于LiP活性的50%～75%。

3 結(jié)論

1）采用搖瓶發(fā)酵相比于靜置發(fā)酵，對誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶更為有利。

2）采用芥子酸作為底物誘導(dǎo)菌株A。FumigatusG-13產(chǎn)木質(zhì)素酶的能力最強，單獨添加羧甲基纖維素的誘導(dǎo)作用強于微晶纖維素，但是弱于添加葡萄糖。

3）搖瓶培養(yǎng)條件下，同時添加葡萄糖及纖維素模型化合物會對木質(zhì)素模型化合物誘導(dǎo)A。Fumigatus G-13產(chǎn)木質(zhì)素酶起到協(xié)同作用。