可降解苯酚的厭氧產(chǎn)電菌株的分離篩選及生物學(xué)特性研究

李金達(dá) 易夢(mèng)雯 王麗麗 付春娜 燕紅

摘要：以含苯酚的厭氧段污水為底物構(gòu)建微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC），從處于穩(wěn)定期的MFC陽(yáng)極分離篩選獲得一株可降解苯酚的厭氧產(chǎn)電菌株A4.對(duì)菌株A4進(jìn)行生理生化鑒定，表明該菌為腸桿菌。以菌株A4作為研究對(duì)象，探究了不同的氮源、碳源、pH值、溫度、初始苯酚濃度、接種量及重金屬離子對(duì)菌株生長(zhǎng)同時(shí)對(duì)苯酚降解情況的影響。研究表明：最適氮源為NH₄NO₃，最佳共代謝基質(zhì)為蔗糖，培養(yǎng)基初始pH值8，最佳初始苯酚濃度500mg/L，最適溫度為23℃，接種量為10%。菌株A4可耐受一定濃度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而對(duì)高濃度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。該菌株在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期產(chǎn)電，測(cè)得64h時(shí)苯酚降解率達(dá)到67.37%，庫(kù)倫效率（CE）為17.8%。研究通過(guò)選育優(yōu)質(zhì)的厭氧產(chǎn)電菌并優(yōu)化其生長(zhǎng)條件，在MFC處理含酚廢水的應(yīng)用上有重要意義。

關(guān)鍵詞：苯酚降解;產(chǎn)電細(xì)菌;分離篩選;生物學(xué)特性;微生物燃料電池

DOI：10.15938/j.jhust.2020.02.020

中圖分類(lèi)號(hào)：0643.3;Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2683（2020）02-0146-10

0 引言

苯酚是原生質(zhì)類(lèi)的芳香化合物，常被用作為化工產(chǎn)業(yè)的原料和反應(yīng)的中間體。酚類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難于降解，直接排放會(huì)對(duì)生物體及環(huán)境造成嚴(yán)重危害。目前處理含酚廢水的方法有物理法（吸附法、溶劑萃取法）、化學(xué)法（氧化法、沉淀法和光催化法）、生物法（活性污泥法、酶處理法）等。物理法和化學(xué)法適用于高濃度的含酚廢水，且有投資高損耗大的缺點(diǎn)，而生物處理法處理含酚廢水是一種低成本的環(huán)境友好型污染修復(fù)方式。近年來(lái)，微生物降解苯酚的研究中，從酚類(lèi)污染的環(huán)境中篩選分離出來(lái)的苯酚降解菌有假單胞菌屬（pseudomonas 3P。）、惡臭假單胞菌（pseudomonasputida）、球形芽抱桿菌（6acillus sphaericus）、紅球菌（rhodococcus Jp。）、根瘤菌（rhizobia。）、不動(dòng)桿菌（acinetobacter sP。）、睪丸酮叢毛單胞菌（comamonas testoterone）、蠟狀芽孢桿菌（bacilluscereus）等。

微生物燃料電池（MFC）是一種新型綠色廢水處理技術(shù)，能夠在處理廢水同時(shí)利用微生物催化將有機(jī)物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成電能，從而引起了廣泛關(guān)注。目前，使用MFC降解含酚廢水的研究多集中于改變MFC的構(gòu)型，而通過(guò)改變MFC的產(chǎn)電性能和影響苯酚降解的因素來(lái)改善電池的電壓和苯酚降解率，獲得純的可降解苯酚的產(chǎn)電微生物為切入點(diǎn)的研究較為少見(jiàn)。在此，考慮到厭氧生物處理法有能耗低，負(fù)荷高的優(yōu)點(diǎn)，將含苯酚的厭氧段工業(yè)廢水樣品為研究樣品，從處于穩(wěn)定期的MFC的陽(yáng)極中分離純化、篩選出可高效降解苯酚的厭氧產(chǎn)電微生物;對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)篩選出的菌株的生長(zhǎng)條件和苯酚降解條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得該菌株最適宜生長(zhǎng)及苯酚降解的條件。最后應(yīng)用于MFC中，從而取得更加優(yōu)越的性能，也為酚類(lèi)等難降解有機(jī)物的高效低耗處理提供思路。

1 材料

1.1污水樣品來(lái)源

采自黑龍江省哈爾濱市文昌污水處理廠A²/O厭氧池的污水。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10s/L，NaCl5g/L，苯酚500mg/L，加蒸餾水配成1000mL，pH值調(diào)至7.2-7.4.

分離培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂18g/L，苯酚500mg/L，加蒸餾水配制1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4.

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH₂PO₄3g/L，Na₂HPO₄6g/L，NaCl 0.5g/L，酵母膏0.2g/L，NH₄Cl 1g/L，CaCl₂0.011g/L，F(xiàn)eSO₄0.025g/L，MgSO₄0.24g/L，苯酚500mg/L。

厭氧液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母膏1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸鈉16.0g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，檸檬酸鐵5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，調(diào)節(jié)pH值為7.

厭氧固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸鈉16.0g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，檸檬酸鐵5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，瓊脂18g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.

1.3 電極緩沖液

陰極緩沖液：Na₂HPO₄2.75g/L，NaH₂PO₄4.22g/L，KMnO₄200mg/L。

陽(yáng)極緩沖液：NH₄Cl 1.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1g/L，CaCl₂0.1g/L，KH₂PO₄0.1g/L。

3.3.2 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降解的影響

苯酚可作為菌株A4的碳源，而外加碳源可以促進(jìn)菌株生長(zhǎng)和增強(qiáng)苯酚降解率，使降解時(shí)間縮短。本研究分別采用蔗糖、乳糖、葡萄糖和乙酸鈉作為外加碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)48h的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)如圖6（a），乳糖對(duì)菌株生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為明顯，OD60達(dá)到0.73.其次為蔗糖，OD₆₀₀為0.68.如圖6（b）所示，當(dāng)添加外加碳源為蔗糖時(shí)，菌株苯酚降解率最高，可達(dá)到29.5%?？赡茉蚴钦崽桥c菌株降解苯酚具有共代謝的作用。綜合菌株的生長(zhǎng)情況、苯酚降解率和經(jīng)濟(jì)效益考慮，選擇蔗糖作為菌株對(duì)苯酚降解的最佳碳源。

3.3.3 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降解的影響

培養(yǎng)基的初始pH值在微生物的生長(zhǎng)及有機(jī)物的降解的過(guò)程中具有重要影響。如圖7（a）所示，隨著初始pH值增長(zhǎng)，菌株A4的生長(zhǎng)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。研究表明，菌株A4適應(yīng)弱堿性的環(huán)境生長(zhǎng)，最適合菌株生長(zhǎng)的初始pH值為8.如圖7（b），當(dāng)pH值為8.0時(shí)，菌株苯酚降解率最高，在此PH條件下培養(yǎng)48h，該菌株對(duì)苯酚的降解率達(dá)50%。綜上分析，選擇pH值為8作為菌株A4的最佳初始pH。

3.3.4 接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降解的影響

接種量對(duì)菌株的生長(zhǎng)量和苯酚降解率的影響如圖8所示。隨著接種量增加，延滯期逐漸縮短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗率增加，苯酚降解率也隨之增大。接種量為2%一5%時(shí)，由于菌量較少，營(yíng)養(yǎng)充足，菌株繁殖速度較快。當(dāng)接種量為10%時(shí)，菌株生長(zhǎng)量和苯酚降解效率分別為0.35和23.58%，高于接種量為1%（0.17和12.53%）、5%（0.28和21.36%）及20%（0.28和14.61%）。接種量為10%時(shí)，菌株生長(zhǎng)量OD₆₀₀為0.35，而接種量超過(guò)10%，OD₆₀₀急劇下降，并且細(xì)菌對(duì)苯酚的降解能力也顯著減弱。原因是當(dāng)接菌量較高時(shí)會(huì)形成碳源競(jìng)爭(zhēng)，抑制菌株的繁殖，影響降解速率。綜合考慮選擇10%作為菌株A4的最佳接菌量。

3.3.5 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降解的影響

生物法處理廢水過(guò)程中，溫度與菌體的酶活力密切相關(guān)，在適宜的溫度范圍內(nèi)，微生物的生理活動(dòng)旺盛，有助于提高其對(duì)有機(jī)污染物的氧化降解和合成代謝能力。由圖9可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，OD₆₀₀值為1.059，生長(zhǎng)量達(dá)到最大;但此溫度條件下，菌株對(duì)苯酚的降解率為16.82%，明顯低于23搜索點(diǎn)對(duì)苯酚的降解率，并且菌株的苯酚降解率隨著溫度的增加而減小。所以37℃為菌株A4生長(zhǎng)的最適溫度，而23℃為該菌株降解苯酚的最適溫度。

3.3.6 初始苯酚濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降影響

工廠排放廢水中有時(shí)苯酚的含量過(guò)高，能否耐受高濃度的苯酚，是衡量菌株實(shí)際應(yīng)用條件的重要性能指標(biāo)。因此本研究針對(duì)菌株A4對(duì)高濃度苯酚的耐受性進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的初始苯酚濃度分別是500mg/L、1000mg/L和2000mg/L。研究表明，如圖10所示，在500mg/L的苯酚廢水中A4的生長(zhǎng)情況最好，此時(shí)的苯酚濃度最有利于對(duì)苯酚的降解。隨初始苯酚濃度的提高，該菌株的生長(zhǎng)明顯受到了抑制，當(dāng)苯酚濃度達(dá)到2000mg/L時(shí)，該菌株對(duì)苯酚的降解能力幾乎消失，說(shuō)明菌株A4不適合在較高濃度的苯酚下應(yīng)用。

3.3.7 金屬離子對(duì)菌株生長(zhǎng)和苯酚降解的影響

圖11表示4種重金屬離子Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺，每種金屬離子質(zhì)量濃度分別為0.01mg/L、0.02ms/L、0.05m8/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L時(shí)，對(duì)菌株A4的生長(zhǎng)量和苯酚降解率的影響。由圖11（a）看出，4種重金屬離子中，菌株對(duì)Pb²⁺的耐受能力最強(qiáng)，48h測(cè)得OD₆₀₀達(dá)到0.4，對(duì)Co²⁺和Cu²⁺次之，而菌株對(duì)Cd²⁺的耐受能力最弱。隨著4種重金屬離子濃度不斷增長(zhǎng)，菌株的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出不同情況。當(dāng)濃度超過(guò)0.05mg/L時(shí)，菌株對(duì)Co²⁺、Cd²⁺及Cu²⁺的耐受性隨濃度增加逐漸減弱。而菌株A4對(duì)Pb²⁺的耐受性則呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，在濃度為0.2mg/L時(shí)OD₆₀₀達(dá)到最大值。

由圖11（b）可見(jiàn)，Cd²⁺、Co²⁺和Pb²⁺濃度從0.01mg/L升高到0.4mg/L過(guò)程中，對(duì)苯酚降解率的抑制作用不斷增強(qiáng)，其中，Cd²⁺作用最為明顯，48h苯酚降解率下降了15.70%。而Pb²⁺對(duì)苯酚降解的促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到0.2mg/L時(shí)，菌A4對(duì)苯酚的降解效率達(dá)到最高水平。由此可以看出，菌株A4可耐受一定濃度的Pb²⁺，在高濃度的Pb²⁺（0.2mg/L）存在時(shí)，菌株A4仍保持較高的苯酚降解能力。

3.4 產(chǎn)電特性初步探討

3.4.1 菌株A4構(gòu)建的MFC

葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作為基質(zhì)，將菌株A4接種到陽(yáng)極，啟動(dòng)MFC，驗(yàn)證菌株的產(chǎn)電能力。運(yùn)行的結(jié)果如圖12所示。菌株A4在MFC中運(yùn)行大致可以分為兩個(gè)時(shí)期，分別為電壓快速上升期和相對(duì)穩(wěn)定期。啟動(dòng)電壓為0.66V，經(jīng)歷約125h的電壓的快速增長(zhǎng)后，電壓趨于平穩(wěn)，在124h處達(dá)到最大電壓718mV。培養(yǎng)基更換后，電壓快速增加，可能是由于陽(yáng)極表面已經(jīng)形成的生物膜在MFC中起重要作用。更換3次培養(yǎng)液，在157h處達(dá)到電壓相對(duì)穩(wěn)定期。隨著電池的運(yùn)行，電壓在穩(wěn)定期的數(shù)值與峰值行的差距逐漸縮小，這可能是由于菌體自身分泌氧化還原性物質(zhì)，從而有效增加了電子的傳遞速率。

陳柳柳等研究表明，葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作為燃料，MFC的庫(kù)倫效率達(dá)到7.2%。駱海萍等研究發(fā)現(xiàn)，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作為燃料，MFC的庫(kù)倫效率可達(dá)到2.3%。范平等利用苯酚（600mg/L）為底物的MFC庫(kù)倫效率為1.47%。通過(guò)構(gòu)建MFC的苯酚降解曲線(xiàn)直觀顯示持續(xù)降解能力。本研究結(jié)果（見(jiàn)圖13）表明：將菌株A4接種到含苯酚（500mg/L）MFC中，苯酚降解率隨著時(shí)間的增加而逐漸升高。在64h時(shí)苯酚降解率達(dá)到最大值67.37%，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)的趨勢(shì)，經(jīng)計(jì)算庫(kù)倫效率為17.38%。本文中菌株A4利用MFC降解苯酚，降解率較低于近幾年文獻(xiàn)報(bào)道的其他菌株，其可能原因是陽(yáng)極室中存在其他非產(chǎn)電細(xì)菌，MFC運(yùn)行過(guò)程中能觀察到陽(yáng)極室上方有氣體的累積，有機(jī)物水解酸化導(dǎo)致溶液pH值降低，而該菌株較適宜在弱堿性環(huán)境中降解苯酚。而庫(kù)倫效率高于其他的以苯酚為燃料的微生物燃料電池。庫(kù)倫效率是反映MFC降解有機(jī)物用來(lái)產(chǎn)電部分所占的比例，庫(kù)倫效率越大，電池能量的轉(zhuǎn)化率越高。陳柳柳等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作為燃料，MFC的庫(kù)倫效率達(dá)到7.2%。駱海萍等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作為燃料，MFC的庫(kù)倫效率可達(dá)到2.3%。范平等僅利用苯酚（600ms/L）為底物的MFC庫(kù)倫效率為1.47%。因此，在能量轉(zhuǎn)化效率方面，利用菌株A4構(gòu)建的MFC具有一定優(yōu)勢(shì)。

3.4.2 菌株產(chǎn)電循環(huán)伏安分析

探究菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期的產(chǎn)電性，對(duì)菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化具有十分重要的意義。使用循環(huán)伏安法測(cè)定菌種是否具有電化學(xué)活性，圖14為菌株A4培養(yǎng)的循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖。含有菌株A4的曲線(xiàn)在穩(wěn)定期有一對(duì)氧化峰和還原峰，氧化峰位于-0.7mV--0.3mV，還原峰在0.5mV～0.7mV附近，這說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)電活性，且菌株在穩(wěn)定期產(chǎn)電。

3.4.3 陽(yáng)極碳?xì)謷呙桦婄R分析

圖15為利用SEM觀察到的生物膜及A4菌體形態(tài)。MFC中陽(yáng)極碳?xì)志哂邢嗷ソ徊娴木W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于菌株A4的附著生長(zhǎng)，從而易于形成生物膜。圖15（c）為MFC運(yùn)行300h后碳?xì)址糯?000倍的SEM圖，陽(yáng)極表面附著了大量桿狀菌體細(xì)胞，生長(zhǎng)較為致密，為菌株A4產(chǎn)電能力提供了直觀證據(jù)，其細(xì)胞膜外沒(méi)有觀察到類(lèi)似納米導(dǎo)線(xiàn)的的衍生結(jié)構(gòu)，菌株只是與電極接觸。猜測(cè)菌株A4可能通過(guò)分泌某些氧化還原介體促進(jìn)電子在微生物中進(jìn)行傳遞。

4 結(jié)論

1）本研究從厭氧池的污水中利用處于穩(wěn)定期的MFC陽(yáng)極分離、純化、篩選出可降解苯酚的厭氧產(chǎn)電菌株A4，并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定為腸桿菌。

2）對(duì)菌株A4的生長(zhǎng)和苯酚降解條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最適菌株生長(zhǎng)及對(duì)苯酚降解的條件：NH₄NO₃為最佳氮源;最佳共代謝基質(zhì)是蔗糖;最佳初始pH值為8;最佳溫度為23℃;最適接種量10%。菌株A4可耐受一定濃度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而對(duì)高濃度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。

3）菌株A4在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期產(chǎn)電，在優(yōu)化的條件下，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作為燃料構(gòu)建的MFC中，最大電壓達(dá)718mV，對(duì)苯酚的降解率達(dá)到67.37%，庫(kù)倫效率為17.8%。利用該菌株構(gòu)建的MFC可高效降解苯酚，同時(shí)在能量轉(zhuǎn)化效率方面也具有明顯的優(yōu)勢(shì)。