甜蕎多糖提取工藝的優(yōu)化及其顆粒劑的制備

張育貴，吳紅偉，李東輝，張淑娟，辛二旦，牛江濤，司昕蕾，李越峰

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730099）

蕎麥?zhǔn)橇慰剖w麥屬蕎麥的種子，其栽培品有普通蕎麥（甜蕎）和韃靼蕎麥（苦蕎）兩種［1］。蕎麥被認(rèn)為是傳統(tǒng)的保健佳品，富含高蛋白、多糖、黃酮、植物甾醇、肌脂等成分［2］，有開(kāi)胃寬腸、下氣消積的功效，用于治療絞腸痧、腸胃積滯、慢性泄瀉等，也可預(yù)防高血脂、高血糖、高血壓等。蕎麥多糖為主要的功能性成分，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)；大量研究表明，蕎麥多糖除具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等藥理作用外［3-5］，還能夠?yàn)樯矬w提供能量，是構(gòu)建細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)還具有保護(hù)生物體的功能［6］。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法優(yōu)化甜蕎多糖的最佳提取工藝，并制備其顆粒劑，為后續(xù)開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甜蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench.），來(lái)源于蓼科植物蕎麥的干燥成熟種子。本研究所用的甜蕎采自陜西定邊，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為正品。

1.2 試劑與儀器

如表1、表2 所示。

1.3 方法與結(jié)果

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.010 0 g，置50.00 mL 容量瓶中，純水溶解，超聲，定容至刻度線，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑及批號(hào)

表2 實(shí)驗(yàn)儀器及型號(hào)

1.3.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 mL 于10.00 mL 的容量瓶中，加入5%苯酚溶液1.50 mL，濃硫酸7.50 mL，定容，60 ℃水浴加熱20 min 后流水冷卻，紫外分光光度計(jì)400～600 nm 范圍內(nèi)掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 依次準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL 于 10 mL 容量瓶中，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備待測(cè)液，以0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液管為空白對(duì)照，在490 nm 處測(cè)定吸光度。如圖1，在濃度為0.002～0.014 mg/mL 時(shí)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程 Y=66.601X-0.053 6（R2=0.998）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取6 份質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.2 mL，按“1.3.2”方法連續(xù)測(cè)定吸光度值并計(jì)算，結(jié)果得RSD 為0.38%，表明儀器精密度良好。

1.3.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.2 mL 6 份，按“1.3.2”方法分別測(cè)定吸光度值并計(jì)算，結(jié)果得RSD 為0.73%，表示該方法重復(fù)性良好。

1.3.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 各取 0.2 mL 按“1.3.2”方法測(cè)定吸光度值并計(jì)算，結(jié)果得RSD 為1.2%，表明樣品穩(wěn)定性較好。

1.3.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取6 份0.9 mg/mL 的定邊甜蕎多糖提取液0.1 mL，分別加入一定量葡萄糖對(duì)照品，測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，如表3。平均回收率為98.13%，RSD 值為1.03%，表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

1.3.5 甜蕎多糖提取工藝 定邊甜蕎粉末20 g（40 目篩）→80%乙醇回流→抽濾→取濾渣→水回流提取→4000 r/min 離心10 min→取上清液，濃縮至25 mL→3 倍量95%乙醇沉淀→靜置24 h→4000 r/min 離心7 min→棄上清液→沉淀加水溶解→定容至250 mL 備用。

1.3.6 單因素試驗(yàn) 影響甜蕎多糖提取工藝的主要因素為提取溫度、提取時(shí)間、料液比，本試驗(yàn)對(duì)這3 個(gè)因素進(jìn)行考察［7］，單因素試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)如表4。

表4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.7 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)［8］在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以吸光度大小為指標(biāo)，用U5（53）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定提取時(shí)間、提取溫度、料液比的最佳組合，從而優(yōu)化甜蕎多糖提取工藝。均勻設(shè)計(jì)的因素水平如表5。

1.3.8 蕎麥多糖顆粒劑的制備及質(zhì)量測(cè)定［9-10］

1.3.8.1 制備方法 將可溶性淀粉、糊精研磨成細(xì)粉，過(guò)50 目篩備用。精確稱取含水量為18%的蕎麥多糖6 g，按一定比例加可溶性淀粉和糊精共18 g 充分混勻，加70%乙醇制軟材，經(jīng)14 目篩制粒，60 ℃干燥3 h，整粒，篩除細(xì)粉，即得蕎麥多糖顆粒，處方比例見(jiàn)表6。

表5 均勻設(shè)計(jì)因素水平表

表6 處方比例

1.3.8.2 顆粒劑主要質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法 ①溶解性測(cè)定：精密稱定表中各處方顆粒0.5 g 加入干燥至恒重的15 mL 離心管中，精密加入沸水10 mL，攪拌振蕩5 min，4000 r/min 離心10 min，棄去上清液，在80 ℃將殘?jiān)娓芍梁阒?，精密稱定，計(jì)算溶化率［溶化率（%）=溶化顆粒質(zhì)量/總顆粒質(zhì)量×100%］。以溶化率100%為25 分，依此類推計(jì)算得分。②成型性測(cè)定：取各處方樣品20 g，分別依次通過(guò)1 號(hào)篩與4 號(hào)篩，以合格顆粒（能通過(guò)1 號(hào)篩但不能通過(guò)4 號(hào)篩的顆粒）的質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比為成型率。以成型率100%為25 分，以此類推計(jì)算得分。③吸濕性測(cè)定［11］：稱取各處方顆粒約2 g，精密稱重，放入已恒重的稱量瓶中，置于相對(duì)濕度75%（氯化鈉飽和溶液密閉24 h 可獲得）條件下，24 h 后取出，精密稱定扁形稱量瓶與樣品的質(zhì)量，測(cè)定吸水量，計(jì)算吸濕率［吸濕率=（吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量）/吸濕前顆粒質(zhì)量×100%］。以吸濕率0%為50 分，對(duì)各處方進(jìn)行扣分，計(jì)算各處方分值。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)蕎麥多糖含量的影響 料液比為1∶15、提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同提取時(shí)間 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 對(duì)蕎麥多糖含量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蕎麥多糖含量的影響

由圖2 可知，隨著提取時(shí)間的不斷增加，蕎麥多糖的提取效果呈升高的趨勢(shì)，在3 h 時(shí)提取效果最好，從2.5 h 至3 h 之間變化幅度不大，增加趨勢(shì)較為平緩，故選取3 h 為最佳提取時(shí)間。

2.1.2 提取溫度對(duì)蕎麥多糖含量的影響 料液比為1∶15、提取時(shí)間3 h 的條件下，考察不同提取溫度 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃對(duì)蕎麥多糖含量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)蕎麥多糖含量的影響

由圖3 可知，隨著提取溫度不斷升高，蕎麥多糖的提取率呈不斷增大的變化趨勢(shì)，在90 ℃提取效果最好，從80 ℃到90 ℃變化趨勢(shì)變小，若再增加溫度，提取率變化不大，故選取90 ℃為最佳提取溫度。

2.1.3 料液比對(duì)蕎麥多糖提取效果的影響 提取時(shí)間3 h、提取溫度為90 ℃的條件下，考察不同料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 對(duì)蕎麥多糖含量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)蕎麥多糖含量的影響

由圖4 可知，隨著料液比不斷增加，蕎麥多糖的提取率呈不斷增大的趨勢(shì)，料液比為1∶20 時(shí)提取效果最好，故選取1∶20 為最佳提取料液比。

2.2 甜蕎多糖含量提取均勻試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）、料液比（X3）為考察因素，以定邊甜蕎多糖含量（Y，多糖含量＝供試品溶液中多糖質(zhì)量濃度×供試品溶液總體積/藥材質(zhì)量）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用均勻設(shè)計(jì)表U5（53）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。稱取定邊甜蕎粉末5 份，每份20.00 g，按“1.3.1”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定樣品中多糖含量。

按U5（53）表安排的試驗(yàn)方案測(cè)定甜蕎多糖含量，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 均勻試驗(yàn)結(jié)果 （n=3）

利用SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析處理，可得到Y(jié) 與料液比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）的回歸方程為：

Y=0.016 37-0.424 9X1+0.048 2X2+0.067 0X3（R2=0.992 5，F(xiàn)=44.092 7>F0.25（3，1）=8.20）

通過(guò)檢驗(yàn)，回歸方程有意義。利用單因素輪換法求回歸方程的極大值（最優(yōu)值），其結(jié)果如下：料液比為1∶10，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80 ℃。按優(yōu)化條件再次進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果為12.27 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，表明優(yōu)化條件可信。

2.3 多糖顆粒劑的制備

2.3.1 溶解性測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 溶解性測(cè)定結(jié)果

2.3.2 成型性測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 成型性測(cè)定結(jié)果

2.3.3 吸濕性測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 吸濕性測(cè)定結(jié)果

2.3.4 綜合評(píng)價(jià) 結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 顆粒劑處方綜合評(píng)價(jià)表

以多糖部位浸膏為原料，采用可溶性淀粉和糊精作為輔料，蕎麥多糖部位與可溶性淀粉和糊精比例為2∶1∶5，并使用70% 乙醇作為潤(rùn)濕劑進(jìn)行顆粒劑的制備，所得顆粒劑成型性、流動(dòng)性好且不易粘連，溶化速度快且靜置后無(wú)沉淀。

3 討 論

本試驗(yàn)最后得到的甜蕎多糖最佳提取工藝為10 倍量水在80 ℃下提取120 min，該條件下提取多糖含量實(shí)測(cè)值為12.27 mg/g；優(yōu)化得到的最佳制粒工藝蕎麥多糖、可溶性淀粉和糊精用量比例為2∶1∶5，并使用70%乙醇作為潤(rùn)濕劑制得顆粒劑成型性、流動(dòng)性好且不易粘連，溶化速度快且靜置后無(wú)沉淀。

本研究探討水提醇沉法對(duì)定邊甜蕎多糖的提取條件及影響因素，確定最佳提取工藝。但是蕎麥多糖屬于復(fù)合性多糖，其具體結(jié)構(gòu)尚不清楚，而在多數(shù)測(cè)定多糖的試驗(yàn)當(dāng)中以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量結(jié)果只能作為參考，因此，在后期的開(kāi)發(fā)研究中可以向研究蕎麥多糖的結(jié)構(gòu)及測(cè)量多糖含量方向發(fā)展。

蕎麥多糖具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、肝損傷保護(hù)、中樞抑制、鉛中毒保護(hù)等作用［12-14］。谷仿麗等［15］發(fā)現(xiàn)蕎麥多糖能使模型小鼠脾臟系數(shù)、吞噬指數(shù)、半數(shù)溶血值、胸腺系數(shù)及足趾厚度差等指標(biāo)顯著提高，表明其具有較好的免疫增強(qiáng)作用。同時(shí)有研究表明，苦蕎多糖對(duì)超氧陰離子、羥基自由基有明顯的抑制作用［16］。張季等［17］研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥多糖可顯著降低鉛中毒小鼠組織和血漿中的鉛含量，并顯著提高鉛中毒小鼠組織和血漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力，降低丙二醛（MDA）含量，表明苦蕎麥多糖可通過(guò)提高抗氧化酶活性和清除自由基，從而改善鉛中毒造成的損傷?；诖?，蕎麥多糖具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)陜西定邊擁有大量的甜蕎資源，利用最優(yōu)的條件提取多糖并開(kāi)發(fā)出顆粒劑作為新的保健食品及醫(yī)藥產(chǎn)品對(duì)于今后利用其預(yù)防和治療人類疾病具有積極的研究?jī)r(jià)值。