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    三氧化二砷通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 mRNA表達(dá)抗骨髓增生異常綜合征血管新生作用的初步研究

    2020-07-15 08:41石秋杰羅瓊尤學(xué)芬
    中外醫(yī)療 2020年13期
    關(guān)鍵詞:三氧化二砷細(xì)胞株生長(zhǎng)因子

    石秋杰 羅瓊 尤學(xué)芬

    [摘要] 目的 探討三氧化二砷通過(guò)下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和SKM-1人骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株(SKM-1細(xì)胞株)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá),具有抗骨髓增生異常綜合征血管新生作用。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方法。觀察:①不同濃度As2O3對(duì)A組(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、B組(經(jīng)SKM-1細(xì)胞株上清液干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)及C組(SKM-1細(xì)胞株)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 mRNA的影響。②相同濃度下,三氧化二砷分別干預(yù)A、B及C 3組12、24、36、48、60、72 h后,其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的影響。結(jié)果 ①隨著三氧化二砷作用濃度的增加,A、B、C 3組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 mRNA表達(dá)顯著下降,并呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系(t=8.636、2.560、13.002,P<0.001);②隨著三氧化二砷作用濃度和時(shí)間的增加,A、B及C 3組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 mRNA表達(dá)均逐漸下降,呈顯著的負(fù)性相關(guān)關(guān)系(P<0.05);③對(duì)A、B組表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較B組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.400,P<0.05)。結(jié)論 三氧化二砷可通過(guò)下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和SKM-1細(xì)胞株的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程而實(shí)現(xiàn)抗血管新生作用,提示骨髓增生異常綜合征細(xì)胞可能分泌上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的物質(zhì),具有促進(jìn)血管新生作用。

    [關(guān)鍵詞] 三氧化二砷;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;SKM-1細(xì)胞株

    [Abstract] Objective To investigate the role of arsenic trioxide in down-regulating the expression of vascular endothelial cell growth factor mRNA in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 human myelodysplastic syndrome cell line (SKM-1 cell line), and have anti-myelodysplastic syndrome blood vessels rejuvenation. Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to amplify vascular endothelial cell growth factor. Observation 1.Different concentrations of As2O3 on vascular endothelial growth factor mRNA in group A (human umbilical vein endothelial cells), group B (intervention of human umbilical vein endothelial cells via the supernatant of SKM-1 cell line) and group C (SKM-1 cell line) impact. 2.At the same concentration, the effects of arsenic trioxide on the vascular endothelial growth factor mRNA in groups A, B and C after 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, and 72 h, respectively. Results 1.With the increase of the concentration of arsenic trioxide, the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A, B, and C decreased significantly and showed a negative correlation (t=8.636, 2.560, 13.002, P<0.001); 2.As the concentration and time of arsenic trioxide increased, the expression of vascular endothelial growth factor mRNA in the three groups A, B and C gradually decreased, showing a significant negative correlation (P<0.05); 3.Comparison of the expression results in groups A and B B The expression of vascular endothelial growth factor mRNA in group was higher than that in group A, and there was a statistical difference (t=3.400, P<0.05). Conclusion Arsenic trioxide can achieve anti-angiogenesis by down-regulating the transcription and translation of vascular endothelial growth factor in human umbilical vein endothelial cells and SKM-1 cell lines,and to suggest that myelodysplastic syndrome cells may secrete up-regulation of blood vessels in vascular endothelial cells endothelial growth factor gene expression substance has the role of promoting angiogenesis.

    [Key words] Arsenic trioxide; Human umbilical vein endothelial cells; Vascular endothelial growth factor; SKM-1 cell line

    大量研究表明,腫瘤的發(fā)生和發(fā)展伴有血管新生,多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤同樣存在血管新生。骨髓增生異常綜合征(骨髓增生)是造血干細(xì)胞異質(zhì)性的克隆性疾病,在疾病的發(fā)展過(guò)程中有一部分會(huì)進(jìn)展為急性白血病,曾有研究表明骨髓增生存在血管新生,同時(shí)與疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)化有密切關(guān)系[1]。血管新生對(duì)造血微環(huán)境的影響以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)自主分泌生長(zhǎng)因子來(lái)刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管的增生。在多種參與腫瘤血管形成的細(xì)胞因子中,血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管新生因子,在腫瘤的血管形成中起關(guān)鍵作用[2]。然而近年來(lái)As2O3在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中均顯示出較廣譜的抗腫瘤效應(yīng)[3]。它作為一種新興的腫瘤血管生成抑制劑,其作用機(jī)制尚不明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管新生的靶細(xì)胞,該研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三氧化二砷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞株和骨髓增生細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制及VEGF基因表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討三氧化二砷的抗血管新生機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料與分組

    1.1.1? 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)分組? 該實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)和SKM-1細(xì)胞株。HUVEC購(gòu)自武漢典型生物保藏中心(CCTCC),SKM-1購(gòu)自日本JCRB細(xì)胞庫(kù)。

    1.1.2? 實(shí)驗(yàn)分組? ①A組:血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC);②B組:血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)與SKM-1細(xì)胞株上清液共同孵育;③C組:SKM-1細(xì)胞株。

    1.1.3? 細(xì)胞株培養(yǎng)? 細(xì)胞株的培養(yǎng)和傳代 ①HUVCE細(xì)胞(A組):HUVCE細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度接種于培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,總體積10 mL。②B組細(xì)胞:A組細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度接種于培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、30%SKM-1細(xì)胞培養(yǎng)上清夜的RPMI 1640培養(yǎng)液中,總體積10 mL。A、B組細(xì)胞均置于37℃,5%CO2,飽和濕度下培養(yǎng)3 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,留取標(biāo)本備用。③SKM-1細(xì)胞(C組):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKM-1細(xì)胞,新鮮培養(yǎng)液洗滌后,重懸于含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,以2×105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度接種于培養(yǎng)瓶,總體積10 mL。置于37℃,5% CO2,飽和濕度下培養(yǎng)3~4 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,留取標(biāo)本備用。

    1.2? 研究方法

    利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的VEGF、β-actin mRNA序列,經(jīng)計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物,再經(jīng)GenBank BLAST進(jìn)行同源性檢測(cè),由上海生物工程有限公司合成兩對(duì)引物,序列如下。

    1.3? RT-PCR法半定量檢測(cè)法

    ①A、B和C組細(xì)胞在不同終濃度的As2O3條件下培養(yǎng)1 d,用RT-PCR法半定量檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)變化。

    ②A、B、C組細(xì)胞株細(xì)胞在As2O3終濃度為12 μmol/L條件下培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h,用RT-PCR法半定量檢測(cè)各組各時(shí)間段VEGF mRNA的表達(dá)變化。

    1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

    采用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RT-PCR法半定量結(jié)果分析:直線相關(guān)分析藥物濃度-時(shí)間與VEGF表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性;A組與B組均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2? 結(jié)果

    2.1? As2O3不同濃度處理后細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)

    ①HUVEC和SKM-1細(xì)胞株均表達(dá)VEGF mRNA ;②隨著As2O3作用濃度的增加,A、B、C 3組VEGF mRNA表達(dá)顯著下降,并呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系;③取As2O3不同濃度處理A、B、C 3組,對(duì)A、B組表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果示HUVEC中加入骨髓增生上清液后VEGF mRNA表達(dá)高于未加組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.400,P<0.05)。提示骨髓增生細(xì)胞可分泌上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF基因表達(dá)的物質(zhì),見(jiàn)表1、2。

    2.2? As2O3不同時(shí)間處理后細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)

    As2O3作用時(shí)間的增加,A、B、C 3組VEGF mRNA表達(dá)也顯著下降, 并呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系,見(jiàn)表3、4。

    3? 討論

    研究發(fā)現(xiàn)不同病期的骨髓增生患者骨髓微血管密度均高于正常對(duì)照組,存在血管新生現(xiàn)象[4]??寡苄律委熢趷盒匝翰≈委熯^(guò)程中其療效高于常規(guī)治療組,具有較好的臨床效果[5]。近年來(lái)有學(xué)者注意到三氧化二砷作用機(jī)制復(fù)雜,能通過(guò)抗腫瘤血管新生,抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制VEGF合成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等多種機(jī)制起到抗腫瘤作用[6-7]。在骨髓增生的治療中,As2O3與HAG的治療效果相近,且不良反應(yīng)較少[8],同時(shí)As2O3聯(lián)合其他方案治療效果均優(yōu)于單純標(biāo)準(zhǔn)方案,且不良反應(yīng)較少[9-11]。三氧化二砷通過(guò)抑制腫瘤血管形成而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),但確切機(jī)制尚不清楚,該課題研究三氧化二砷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成基因表達(dá)等方面的影響,探討其抗血管新生的作用機(jī)制。

    VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素,其在生理及病理狀態(tài)血管形成過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[12]。在惡性血液病患者臨床輔助診斷及預(yù)后評(píng)估中具有一定的應(yīng)用價(jià)值[13]。VEGF與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可通過(guò)促進(jìn)微血管的增生來(lái)調(diào)控白血病細(xì)胞的增殖分化,抑制VEGF 與其受體VEGFR 結(jié)合,從而阻止白血病細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成,達(dá)到預(yù)防及治療白血病的目的[14]。

    該研究應(yīng)用RT-PCR半定量法檢測(cè)表明,HUVEC和SKM-1細(xì)胞株均表達(dá)VEGF mRNA。隨著As2O3作用濃度和時(shí)間的增加,HUVEC、SKM-1及SKM-1培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞株中VEGF mRNA表達(dá)逐漸下降;3組表達(dá)均與濃度、時(shí)間呈顯著的負(fù)性相關(guān)關(guān)系。因此,As2O3可同時(shí)通過(guò)下調(diào)HUVEC和SKM-1細(xì)胞株中VEGF mRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抗血管新生作用。與Kimura[15]研究顯示As2O3可下調(diào)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的活性,從而使腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)下降,結(jié)論一致。與相關(guān)研究[2]顯示高濃度As2O3可顯著抑制HUVEC增殖,且抑制作用具有時(shí)間及劑量依賴性(P<0.05),結(jié)論一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SKM-1培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞株VEGF mRNA的表達(dá)高于HUVEC細(xì)胞株,提示骨髓增生細(xì)胞能分泌上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的細(xì)胞因子。根據(jù)羅瓊等人[16]的研究結(jié)果顯示,骨髓增生患者骨髓微血管密度(MVD)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01),隨著病程的進(jìn)展患者的MVD呈增高趨勢(shì)(Rs=0.861 3,P<0.05);②As2O3對(duì)HUVEC及SKM-1細(xì)胞株干預(yù)組的作用均表現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性的增殖抑制效應(yīng)(F=10.92,P<0.05);③HUVEC中加入SKM-1上清液共同培養(yǎng)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯作用(P<0.01)。

    綜上所述,As2O3通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),下調(diào)HUVEC和SKM-1細(xì)胞株中VEGF表達(dá)而減少VEGF產(chǎn)量,從而具有抗血管新生作用。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]? 曾俊權(quán).骨髓增生異常綜合征患者骨髓血管新生及與臨床特征的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,35(22):6526-6528.

    [2]? 王魯,常艷麗,張青云.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腫瘤血管形成中的作用及其靶向治療研究進(jìn)展[J].中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志,2015,3(3):146-152.

    [3]? 尤學(xué)芬,羅瓊,秦燕,等.骨髓增生異常綜合征骨髓血管新生的研究[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34(10):1027-1028.

    [4]? 羅瓊,石秋杰,尤學(xué)芬,等.三氧化二砷抗骨髓增生異常綜合征骨髓血管新生機(jī)制的初步探討[J].山西醫(yī)藥雜志,2012,41(15):758-761.

    [5]? 于果.抗血管新生治療在血液腫瘤治療中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2015,13(34):108-109.

    [6]? 高靜,陳蓓蕾.三氧化二砷治療腫瘤臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(6):758-759.

    [7]? 劉偉華,李丹,謝坤霞,等.三氧化二砷對(duì)腫瘤血管新生作用的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)地理分冊(cè),2015,36(3):174-177.

    [8]? 李紅藝.三氧化二砷與HAG方案治療骨髓增生異常綜合征的對(duì)比分析[J].北方藥學(xué),2017,14(2):174-175.

    [9]? 劉昌勛. 三氧化二砷與阿糖胞苷聯(lián)合治療骨髓增生異常綜合征17例療效觀察[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2017,8(4):81-83.

    [10]? 王雪青,陳玉成.三氧化二砷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究[J].心臟雜志,2015,27(4):415-417.

    [11]? 吳春農(nóng),宋光彩,張杰.三氧化二砷治療老年高危骨髓增生異常綜合征療效觀察[J].四川醫(yī)學(xué),2017,38(1):66-68.

    [12]? 王魯,常艷麗,張青云.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腫瘤血管形成中的作用及其靶向治療研究進(jìn)展[J].中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志,2015(3):146-152.

    [13]? 陳玥,王建,成張林.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子血清水平檢測(cè)在急性白血病患者臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2018,17(8):832-834.

    [14]? 劉爽,賈舒麟,張夢(mèng)凡,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在白血病中相關(guān)作用的機(jī)制[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2018,39(6):470-472.

    [15]? Kimura H, Weisz A,Kurashima Y, et al. Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth factor gene mediates transcriptional regulation by nitric oxide: control of hypoxia-inducible factor-1 activity by nitric oxide[J].Blood,2000,95(1):189-197.

    [16]? 羅瓊,石秋杰,尤學(xué)芬.三氧化二砷抗骨髓增生異常綜合征骨髓血管新生機(jī)制的初步探討[J].山西醫(yī)藥雜志,2012,41(8):758-761.

    (收稿日期:2020-12-04)

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