黃芩苷對(duì)慢性心肌衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)的影響

劉 宇,高 玲

0 引 言

慢性心力衰竭是各種功能性或器質(zhì)性心臟病造成心室射血能力受損的一種綜合征，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及威脅患者生命安全[1-3]。因此，采取及時(shí)有效的診斷和治療慢性心力衰竭方法尤為重要[4]。研究報(bào)道顯示，Akt/腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-Activated Protein Kinase，AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路主要是自噬的經(jīng)典通路，該通路的紊亂會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病，包括自身免疫性疾病、腎病變，心臟病變等[5]。黃芩苷是從中藥黃芩根莖中分離純化的一種黃酮類單體化合物，具有抗細(xì)胞凋亡和抗氧化等多種生物學(xué)功能，在提高心肌功能和改善心肌缺血方面具有一定作用[6]。本文研究旨在探討黃芩苷對(duì)慢性心肌衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Akt/AMPK/mTOR信號(hào)通路表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠(SPF級(jí))60只，體重(180±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日給予12 h光照，控制相對(duì)濕度(55±2)%，控制溫度(22±2)℃，動(dòng)物飼料、飲用水和墊料均已消毒，大鼠來(lái)自北京維通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)藥物：黃芩苷(來(lái)自于西安昊軒生物科技公司，純度99.8%)，氯沙坦鉀片(購(gòu)自浙江華海藥業(yè)股份有限公司)，批號(hào)：1357L19001。

1.2 主要試劑和儀器主要試劑：心肌細(xì)胞凋亡試劑盒(來(lái)自于武漢博士的生物技術(shù)有限公司)；二步法TV6001免疫組化檢測(cè)試劑盒及Bax、Bcl-2一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Akt、AMPK、mTOR mRNA單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)，引物設(shè)計(jì)及合成(上海生工生物工程公司股份有限公司)。主要儀器：SQ2125型石蠟切片機(jī)(徠克公司)，ABI-7300型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(美國(guó)ABI公司)，Vevo 770高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(Visual Sonics)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備以腹主動(dòng)脈縮窄法建立，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射(45 mg/kg)麻醉后，于大鼠腹部正中切口，分離腎動(dòng)脈的腹主動(dòng)脈長(zhǎng)1 cm左右，以7號(hào)針頭緊貼腹主動(dòng)脈平行放置，結(jié)扎，將7號(hào)針頭抽出，可使腹主動(dòng)脈部分狹窄。術(shù)后給予10 000 U青霉素肌肉注射，1次/d，連續(xù)3 d。3周后，若出現(xiàn)失代償性癥狀，即勞力性呼吸困難、心動(dòng)過(guò)速和呼吸急促，且經(jīng)彩色超聲心動(dòng)儀檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)<45%，則體質(zhì)慢性心力衰竭造模成功。除正常組，其余各組大鼠均造模成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各15只。陽(yáng)性對(duì)照組給予氯沙坦鉀片40 mg/kg灌胃， 1次/d；實(shí)驗(yàn)組給予黃芩苷50 mg/kg灌胃， 1次/d；正常組和模型組灌胃等劑量等滲鹽水， 1次/d。各組灌胃4周。

1.3.3 心肌細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)取大鼠心臟，以預(yù)冷等滲鹽水沖洗。取部分左心室，取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小的組織塊置于10%甲醛固定48 h，HE染色，采用中性樹(shù)膠封固，放入65 ℃烤箱中15 min，顯微鏡拍照。

1.3.4 心肌組織細(xì)胞指數(shù)(CAI)測(cè)定采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)。陽(yáng)性染色細(xì)胞為有棕褐色顆粒。每張切片(隨機(jī)選取5張)隨機(jī)選取視野5個(gè)，計(jì)數(shù)100個(gè)心肌細(xì)胞，記錄TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，且以每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性數(shù)為凋亡指數(shù)。

1.3.5 心肌Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)按照二步伐TV6001免疫組化試劑盒說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)操作，各組每個(gè)心肌標(biāo)本連續(xù)切片，其中Bax和Bcl-2染色各取切片1張，棕褐色陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于細(xì)胞漿，以計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)半定量分析，攝400×圖像輸入分析系統(tǒng)內(nèi)，測(cè)定平均灰度值，其中每張切片選擇無(wú)重疊視野5個(gè)，以灰度值大小作為蛋白的陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)。

1.3.6 心臟超聲測(cè)定超聲系統(tǒng)檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDEDD)、左心室收縮期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)。

1.3.7Akt、AMPK、mTORmRNA測(cè)定提取RNA，測(cè)定RNA濃度，使用2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)完成后，進(jìn)行RT-PCT反應(yīng)，具體引物序列(5′-3′)：Akt - TGTCTCGTGAGCGCGTGTTTT CCGTTATCTTGATGTGCCCGTC，產(chǎn)物長(zhǎng)度159 bp；AMPK - GCGAAGGAAGAACCC TCACGGATGAGGTAAGAG，產(chǎn)物長(zhǎng)度66 bp；mTOR - AGTGAAGCCGAGAGCAATGAGA GACAAGGAGATAGAACGGAAGAAGC，產(chǎn)物長(zhǎng)度134 bp；GAPDH - CAACGGGAAACCCATCACCA ACGCCAGTAGACTCCACGACAT，產(chǎn)物長(zhǎng)度96 bp。引物濃度0.3 μmol/L，cDNA使用2 μL，反應(yīng)條件：95℃ 10 s變性，60 ℃ 32 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定CT值，內(nèi)參采用GAPDH，以2-ΔΔCT分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料采用F檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組對(duì)心肌大鼠心肌細(xì)胞病理影像學(xué)影響光鏡下觀察，正常組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，橫、縱紋正常，及細(xì)胞質(zhì)正常；模型組大鼠心肌肌纖維增增粗，心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，且部分心肌細(xì)胞患者，伴不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠心肌肌纖維排列紊亂，心肌纖維增粗，且部分心肌細(xì)胞肥大，以及伴部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌纖維排列稍紊亂，少量心肌細(xì)胞肥大，以及伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

a:正常組； b:模型組； c:陽(yáng)性對(duì)照組； d:實(shí)驗(yàn)組

圖1 各組對(duì)心肌大鼠心肌細(xì)胞病理影像學(xué)影響(HE ×200)

Figure 1 Effect of each group on pathological imaging of myocardial cells in rats (HE staining ×200)

2.2 各組大鼠CAI比較與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CAI升高(P<0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組較模型組降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠心肌Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)下降而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)升高而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別nCAIBcl-2Bax正常組151.27±0.21149.83±14.32134.25±18.97模型組1565.38±7.89?102.64±8.98?218.73±15.42?陽(yáng)性對(duì)照組1523.69±7.53?#133.73±12.10?#163.29±23.15?#實(shí)驗(yàn)組1525.05±8.91?#135.62±10.87?#162.10±27.36?#

與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.4 各組大鼠心功能變化比較與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組LVEF下降而LVD和LVS增加(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組LVEF升高而LVD和LVS下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別nLVEF(%)LVD(mm)LVS(mm)正常組1550.83±2.140.74±0.130.57±0.13模型組1534.25±2.87?1.39±0.16?0.96±0.12?陽(yáng)性對(duì)照組1539.25±2.01?#1.15±0.14?#0.78±0.10?#實(shí)驗(yàn)組1542.34±1.90?#△0.93±0.10?#△0.69±0.12?#△

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

2.5 各組大鼠Akt、AMPK、mTOR mRNA表達(dá)比較與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Akt、AMPK、mTOR mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Akt、AMPK、mTOR mRNA表達(dá)上升(P<0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Akt、AMPK、mTOR mRNA表達(dá)比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別nAkt mRNAAMPK mRNAmTOR mRNA正常組151.001.001.00模型組150.54±0.09?0.43±0.11?0.67±0.08?陽(yáng)性對(duì)照組150.79±0.10?#0.68±0.17?#0.80±0.09?#實(shí)驗(yàn)組150.78±0.12?#0.71±0.19?#0.82±0.05?#

與正常組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

慢性心力衰竭主要是由于多種原因?qū)е碌纳溲芰κ軗p或心室充盈的復(fù)雜的一種臨床癥候群，具有病情發(fā)展、發(fā)病率高等特點(diǎn)，是全球面臨的重大醫(yī)療問(wèn)題之一[7-10]。因此，臨床上采取及時(shí)有效的診斷和治療慢性心力衰竭方法尤為重要。黃芩苷主從黃芩根莖中分化純化的一種黃酮類單體化合物，藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有多種生物活性，如抗過(guò)敏、抗凋亡和抗氧化作用、抑菌作用及增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用等[11]。此外研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷用于多種心血管疾病中發(fā)揮良好作用，可減少心肌細(xì)胞的凋亡，且具有保護(hù)心臟損傷大鼠心臟作用[12-13]。本文研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CAI降低，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組LVEF升高而LVD和LVS下降，由此提示黃芩苷可抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷。細(xì)胞凋亡主要是遺傳基因控制的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程，是機(jī)體不再需要的細(xì)胞及癌變細(xì)胞的自身防御性機(jī)制、清除嚴(yán)重受損的細(xì)胞，包括Bcl-2家族蛋白的調(diào)控等機(jī)制。Bax和Bcl-2是調(diào)控心肌細(xì)胞的關(guān)鍵凋亡基因，并且兩者比例決定心肌細(xì)胞在受凋亡刺激后是存活還是死亡。慢性心力衰竭時(shí)存在廣泛的心肌細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2表達(dá)明顯降低而B(niǎo)ax表達(dá)明顯升高。本文研究結(jié)果顯示，模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)升高而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)下降，由此提示黃芩苷可上調(diào)Bcl-2表達(dá)而下調(diào)Bax表達(dá)。

Akt/AMPK/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞中關(guān)鍵生存信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等活動(dòng)，以往多用于癌癥細(xì)胞的遷移過(guò)程[14]。最近的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，mTOR信號(hào)通路參與腎臟疾病發(fā)病機(jī)制如急性腎損傷、糖尿病性腎病和多囊腎疾病[15]。在糖尿病腎病mTOR通路激活是與間質(zhì)纖維化，腎小管萎縮和腎小球?yàn)V過(guò)率逐漸下降密切相關(guān)，阻斷mTOR信號(hào)通路將會(huì)延緩糖尿病腎病進(jìn)展。但目前臨床上尚無(wú)有關(guān)Akt/AMPK/mTOR信號(hào)通路與慢性心力衰竭方面研究。AMPK主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，其活性主要由AMP/ATP比例控制，保持機(jī)體能量平衡。同時(shí)，AMPK可參與調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞分泌胰島素的末端緩解，并且在胰島β細(xì)胞內(nèi)，葡萄糖能夠通過(guò)氧化代謝改變細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸水平，進(jìn)一步影響AMPK活性。目前，尚無(wú)有關(guān)AMPK與慢性心肌衰竭方面研究，但認(rèn)為心力衰竭時(shí)心肌能量代謝出現(xiàn)“胚胎化”，而胚胎化主要是指胚胎發(fā)育階段心肌細(xì)胞能量供應(yīng)來(lái)源于乳酸氧化和糖酵解，故而認(rèn)為AMPK可能與慢性心力衰竭發(fā)病相關(guān)[16]。本文通過(guò)初步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Akt、AMPK、mTOR mRNA表達(dá)上升，由此提示黃芩苷可上調(diào)Akt/AMPK/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，但具體機(jī)制尚未十分明確，還需在后續(xù)中深入研究。

綜上所述，黃芩苷可減輕慢性心肌衰竭大鼠心肌損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Akt/AMPK/mTOR信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)，具有重要研究?jī)r(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。