人腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2的生物信息學(xué)分析

張玉潔，孫怡琳，朱 蘋，馬曉麗

0 引 言

有效的腫瘤標(biāo)志物可以反映腫瘤的生物學(xué)特性，對腫瘤診斷、治療及預(yù)后有重要意義。腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號傳導(dǎo)因子2(tumor associated calcium signal transducer 2，TACSTD2)在許多人類腫瘤中高表達(dá)，其染色體位置1q32.1是一個基因編碼的腫瘤相關(guān)抗原。該抗原是轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣信號的細(xì)胞表面受體[1]，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長中發(fā)揮作用[2]。TACSTD2最早從正常和惡性滋養(yǎng)細(xì)胞中鑒定出來，在人類合體細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在特異性高表達(dá)，有研究將其描述為滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面標(biāo)志物，可用于檢測和分離孕婦血液中循環(huán)的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，以及用于絨癌等生殖細(xì)胞瘤患者的診斷和治療[3]。TACSTD2還與膠滴狀角膜營養(yǎng)不良有關(guān)[4-6]。越來越多的研究證明，TACSTD2在人實體腫瘤中的表達(dá)增加調(diào)節(jié)了與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的生物過程，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用，可作為腫瘤的生物標(biāo)志物，成為非常有希望的治療靶標(biāo)[7-10]。本研究通過生物信息學(xué)方法，對TACSTD2的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析和預(yù)測，為進(jìn)一步探索TACSTD2的分子功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)獲取人源性TACSTD2基因mRNA序列GI：1653961507，TACSTD2蛋白氨基酸序列CAG47056.1。TACSTD2蛋白氨基酸序列的FASTA文件格式：MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL。

1.2方法

1.2.1人源性TACSTD2的開放閱讀框架預(yù)測登陸NCBI官網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，將TACSTD2的mRNA序列GI輸入開放閱讀框架(Open Reading Frame, ORF)Finder在線工具，得到TACSTD2基因的ORF。

1.2.2人源性TACSTD2蛋白的理化性質(zhì)分析通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniprot/?query=TACSTD2&sort=score)，獲得TACSTD2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，登錄查詢TACSTD2的ID為P09758，輸入Prot-Param(http://expasy.org/tools/protparam.html)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測TACSTD2蛋白的理化性質(zhì)，包括蛋白的分子量、氨基酸組成、脂肪指數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等參數(shù)。用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析該蛋白的親水和疏水性。用Window size=13時計算窗口內(nèi)每個位置上氨基酸的標(biāo)度權(quán)值。

1.2.3人源性TACSTD2的信號肽預(yù)測運用Signal P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，通過對目的肽鏈前70個氨基酸間潛在酶切位點的預(yù)測來判斷是否存在信號肽。設(shè)置Cut-off 值為0.450，預(yù)測C、Y、S-score，S 的平均值可以用來判斷是否為分泌蛋白(S>0.5，為分泌蛋白且有信號肽)，Y 的最大值用來判斷信號肽的剪切位點。

1.2.4人源性TACSTD2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測通過NLStradamus 工具預(yù)測其蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞核定位；用PSORT Ⅱ軟件分析TACSTD2蛋白的細(xì)胞定位。

1.2.5人源性TACSTD2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測將TACSTD2蛋白氨基酸序列的FASTA文件輸入TMHMM 在線軟件，對TACSTD2蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

1.2.6人源性TACSTD2蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)分析將TACSTD2蛋白氨基酸序列用Predict-Protein工具中的PROF Sec 法分析TACSTD2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用SOPMA分析TACSTD2蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成，將構(gòu)象數(shù)目設(shè)置為3(Helix，Sheet，Coil)，其它的參數(shù)默認(rèn)為原始數(shù)據(jù)。用SWISS-MODEL在線工具通過同源建模法構(gòu)建TACSTD2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。

1.2.7人源性TACSTD2蛋白的基本結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用NCBI里的CD-search在線程序直接對TACSTD2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.8人源性TACSTD2蛋白的蛋白質(zhì)修飾位點分析通過DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)工具預(yù)測TACSTD2蛋白磷酸化位點；用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線工具預(yù)測TACSTD2蛋白的糖基化位點，包括O型糖基化位點和N型糖基化位點。

1.2.9人源性TACSTD2蛋白的互作蛋白和通路分析采用String工具預(yù)測與TACSTD2相互作用的蛋白，GO分析TACSTD2參與的信號通路。

1.2.10人源性TACSTD2蛋白的基因表達(dá)譜分析采用Gene Expression Display Server在線數(shù)據(jù)庫直接輸入TACSTD2的基因名，獲得TACSTD2的蛋白和mRNA水平在不同組織及腫瘤中的情況。

2 結(jié) 果

2.1TACSTD2基因ORF分析TACSTD2的mRNA序列得到的ORF有12個，最長的ORF是ORF1，共972bp，可編碼323個氨基酸。ORF1的序列(CAG47056.1)與TACSTD2的氨基酸序列一致。

2.2TACSTD2蛋白的理化性質(zhì)分析TACSTD2蛋白分子量為35709.40，蛋白質(zhì)的總分子式為C1561H2556N466O455S18，原子總數(shù)：5056。含有323個氨基酸殘基，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)36個，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)47個。理論等電點pI為9.14，說明蛋白偏堿性。氨基酸組成中，Ala(A)27(8.4%)個、Arg(R)30(9.3%)個、Asn(N)9(2.8%)個、Asp(D)20(6.2%)個、Cys(C)12(3.7%)個、Gln(Q)10(3.1%)個、Glu(E)16(5.0%)個、Gly(G)24(7.4%)個、His(H)8(2.5%)個、Ile(I)12(3.7%)個、Leu(L)39(12.1%)個、Lys(K)17個(5.3%)、Met(M)6(1.9%)個、Phe(F)7(2.2%)個、Pro(P)19(5.9%)個、Ser(S)15(4.6%)個、Thr(T)17(5.3%)個、Trp(W)1(0.3%)個、Tyr(Y)8(2.5%)個、Val(V)26(8.0%)個。TACSTD2蛋白的不穩(wěn)定指標(biāo)達(dá)到了40.77，為不穩(wěn)定蛋白。

TACSTD2蛋白的脂肪指數(shù)為93.28，親水性的平均值為-0.228。TACSTD2蛋白最大的疏水性分值為3.8，親水性最大的數(shù)值為-2.3。圖1顯示TACSTD2蛋白親水性的氨基酸多于疏水性的氨基酸，表明TACSTD4蛋白屬于親水性蛋白。

圖 1 TACSTD2蛋白親水性和疏水性分析

Figure 1 Hydrophilicity-hydrophobicity analysis of human TACSTD2 protein

2.3TACSTD2蛋白信號肽預(yù)測及蛋白質(zhì)定位TACSTD2蛋白存在信號肽：剪切位點C 的最大值為0.846，位于31位氨基酸，綜合剪切位點Y 最大值為0.879，位于31位氨基酸，信號肽S 最大值為0.985，其預(yù)測的剪切點在1-30位氨基酸。S 平均值為0.913，能夠形成經(jīng)典的信號肽區(qū)域，說明TACSTD2蛋白是分泌蛋白且有信號肽。在第30-31位氨基酸殘基間C值最大，S值陡峭，Y值最高峰，預(yù)測為信號肽剪切位點。NLStradamus 工具預(yù)測結(jié)果顯示，TACSTD2氨基酸序列存在NLS，提示TACSTD2可定位于細(xì)胞核。見圖2。

圖 2 TACSTD2蛋白的信號肽分析

Figure 2 Signal peptide analysis of human TACSTD2 protein

2.4TACSTD2蛋白的亞細(xì)胞定位分析TACSTD2蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外、細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)，提示TACSTD2蛋白為分泌蛋白，可以在細(xì)胞外及細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，見圖3。

圖 3 TACSTD2蛋白的亞細(xì)胞定位

Figure 3 Subcellular localization of human TACSTD2 protein

2.5TACSTD2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的分析TACSTD2蛋白主要在細(xì)胞膜外，部分在跨膜區(qū)，而細(xì)胞內(nèi)較少，提示TACSTD2蛋白在細(xì)胞外的部分可以作為抗原表位發(fā)揮作用。見圖4。

圖示紅色陰影為跨膜區(qū)

圖 4 TACSTD2蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測

Figure 4 Prediction of transmembrane region ofhuman TACSTD2 protein

2.6TACSTD2蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三維模型TACSTD2蛋白主要為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其次為螺旋結(jié)構(gòu)；其二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占25.39%，無規(guī)卷曲占52.01%，延伸鏈占22.60%，無規(guī)卷曲常展示在蛋白質(zhì)表面，有利于抗原抗體的相互作用；溶劑可及性分析結(jié)果主要為暴露。見圖5。TACSTD2氨基酸序列(第31-273位氨基酸)與其模板4mzv.1.A存在48.54%相似度，屬于上皮細(xì)胞黏附分子蛋白家族。見圖6。

圖 5 TACSTD2蛋白的二級結(jié)構(gòu)

Figure 5 Prediction of secondary structure of TACSTD2 protein

圖 6 TACSTD2蛋白的三維模型

Figure 6 3D structure of human TACSTD2 protein

2.7TACSTD2蛋白的結(jié)構(gòu)域分析TACSTD2蛋白在72-145位置有一個I型甲狀腺球蛋白重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域，人甲狀腺球蛋白的N端區(qū)域包含11個Ⅰ 型TY重復(fù)序列是半胱氨酸蛋白酶的抑制劑。

2.8TACSTD2蛋白修飾位點預(yù)測分析TACSTD2蛋白有15個絲氨酸修飾位點，17個蘇氨酸修飾位點，8個酪氨酸修飾位點。見圖7。糖基化位點預(yù)測的結(jié)果見圖8，綠色線條代表一個糖基化修飾位點，共4個，所以TACSTD2 蛋白序列中存在4個N型糖基化修飾位點。

圖 7 TACSTD2蛋白磷酸化位點預(yù)測

Figure 7 Phosphorylation analysis of human TACSTD2 protein

圖 8 TACSTD2蛋白糖基化位點預(yù)測

Figure 8 Analysis of human TACSTD2 N-glycosylation

2.9與TACSTD2蛋白相互作用的蛋白及生物學(xué)功能預(yù)測TACSTD2與CLDN1、CLDN7、CLDN4、CYP8B1、KRTAP5-2、ATP6V1B1、TJP1、ACTB、ATP1A1等蛋白存在相互作用。見圖9。根據(jù)GO分析結(jié)果，TACSTD2參與以下信號通路：細(xì)胞表面受體信號通路(GO0007166)、視覺感知(GO：0007601)細(xì)胞增殖(GO：0008283)、上皮細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控(GO：0010633)、上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(GO：0050678)、對刺激的反應(yīng)(GO：0050896)、應(yīng)力纖維組件的負(fù)調(diào)節(jié)(GO：0051497)、輸尿管芽形態(tài)發(fā)生(GO：0060675)、輸尿管芽形態(tài)發(fā)生中分支的負(fù)調(diào)控(GO：0090191)、細(xì)胞間黏附(GO：0098609)、底物黏附依賴性細(xì)胞擴(kuò)散的負(fù)調(diào)控(GO：1900025)、皺褶組件的負(fù)調(diào)控(GO：1900028)、細(xì)胞運動的負(fù)調(diào)控(GO：2000146)、干細(xì)胞分化的正調(diào)控(GO：2000738)。

圖 9 String預(yù)測與TACSTD2相互作用的蛋白

Figure 9 Protein-protein interaction network for TACSTD2

2.10TACSTD2在人體正常組織和腫瘤中的表達(dá)TACSTD2蛋白在皮膚、膽囊、肺、肝等不同的組織中均有表達(dá)，在血管、睪丸、肌肉、心臟和腦組織中細(xì)胞系和對應(yīng)的組織中表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖10。與正常組織比較，TACSTD2的mRNA在宮頸癌、肺癌、甲狀腺癌、子宮癌、肝癌、結(jié)直腸癌中高表達(dá)。見圖11。

與對應(yīng)細(xì)胞系比較，*P<0.05

圖 10 TACSTD2蛋白在不同組織中的分布

Figure 10 Expression of TACSTD2 protein in different tissues

圖 11TACSTD2 mRNA在不同腫瘤中的分布

Figure 11 Expression of TACSTD2 mRNA in differenttumor types

3 討 論

本研究通過對人源性TACSTD2進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測TACSTD2基因無內(nèi)含子，TACSTD2蛋白是偏堿性不穩(wěn)定親水性蛋白。TACSTD2由一個大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)尾巴組成。蛋白質(zhì)的定位信息存在于該蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)中，通過與膜上特殊的受體相互作用而得以表達(dá)。TACSTD2蛋白位于膜外區(qū)域的氨基酸序列可作為抗原表位，發(fā)揮膜受體蛋白的作用。TACSTD2蛋白有信號肽形成區(qū)域，有一個I型甲狀腺球蛋白重復(fù)序列的跨膜結(jié)構(gòu)域，是分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外、細(xì)胞膜上的分泌蛋白，主要的二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，溶劑可及性分析結(jié)果為暴露；三維結(jié)構(gòu)顯示它屬于上皮細(xì)胞粘附分子家族，含有多個絲氨酸和糖基化的修飾位點，與CLDN1等蛋白相互作用，參與細(xì)胞的增殖、遷移、粘附等過程，在多種人實體腫瘤中高表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TACSTD2基因在起始密碼子之后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA片段，這個氨基酸序列就是TACSTD2的信號肽序列。而含有跨膜區(qū)的蛋白往往和細(xì)胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)，蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)提示它可能作為膜受體起作用，也可能是位于膜的錨定蛋白或者離子通道蛋白[11]。三維結(jié)構(gòu)模型顯示，TACSTD2在拓?fù)渖戏譃橐粋€較大的N末端胞外部分(Trop2EC)，該部分由三個結(jié)構(gòu)域組成，該區(qū)域通過一個跨膜螺旋(TM)固定在細(xì)胞膜中，隨后是26個氨基酸殘基的短細(xì)胞內(nèi)尾巴(Trop2IC)。模塊化的Trop2EC進(jìn)一步分為一個小的N端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)，一個甲狀腺球蛋白1型結(jié)構(gòu)域(TY)和一個缺乏半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CPD)[12]。分子的特定拓?fù)鋮^(qū)域涉及不同的過程。例如，在調(diào)節(jié)的膜內(nèi)蛋白水解切割過程中，將Trop2EC和Trop2IC從TM部分切割下來。釋放的Trop2IC通過β-catenin信號傳導(dǎo)途徑間接影響細(xì)胞增殖和自我更新[13]。接下來，TACSTD2充當(dāng)鈣信號轉(zhuǎn)換器。此時，Trop2EC通過單克隆抗體在細(xì)胞膜上的交聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高[14]。該機(jī)制可能涉及Trop2IC中的PIP2結(jié)合位點[15]。此外，最近的報告顯示，在肺發(fā)育過程中，TACSTD2可能充當(dāng)IGF-1 / IGF-1R信號傳導(dǎo)途徑的衰減劑，其中Trop2EC與IGF-1R競爭IGF-1結(jié)合[16]。Trop2EC的其他結(jié)合伴侶是跨膜蛋白CLAUDIN-1和-7，它們在上皮屏障的緊密連接中起重要的結(jié)構(gòu)和功能作用。據(jù)推測，TACSTD2在CLAUDIN重排過程中充當(dāng)錨或轉(zhuǎn)運蛋白，或者它充當(dāng)防止CLAUDIN降解的穩(wěn)定劑。TACSTD2在維持緊密連接完整性方面的重要性得到了以下觀察的支持：TACSTD2基因功能喪失導(dǎo)致緊密連接相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位的表達(dá)降低和重排，從而影響上皮屏障的性能[17]。

在生物內(nèi)，蛋白質(zhì)的合成場所與功能場所常被一層或多層細(xì)胞膜隔開，這樣就涉及到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。合成的蛋白質(zhì)只有準(zhǔn)確地定向運行才能保證生命活動的正常進(jìn)行。TACSTD2是一種糖蛋白，最初被鑒定為滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面標(biāo)志物，但隨后在許多實體癌中顯示出增加的表達(dá)，在某些正常組織中表達(dá)較低[10]。含有信號肽的蛋白質(zhì)一般都是分泌到細(xì)胞外，可能作為重要的細(xì)胞因子起作用，有潛在的應(yīng)用價值[18]。通過幾種信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)癌癥的生長，侵襲和擴(kuò)散，并在干細(xì)胞生物學(xué)和其他疾病中起作用。有一些研究表明高TACSTD2表達(dá)的生物學(xué)機(jī)制與癌癥的侵襲性有關(guān)[19-20]。EI Sewedy等[21]的研究表明，TACSTD2的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸結(jié)合位點具有被蛋白激酶C磷酸化的能力；因此，通過TACSTD2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有可能引起癌細(xì)胞的侵襲性。高TACSTD2表達(dá)將通過旁分泌和自分泌信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞的生物學(xué)攻擊，可作為腫瘤治療的新靶標(biāo)[7]。

綜上所述，本研究通過對TACSTD2的分析發(fā)現(xiàn)，該分子在腫瘤的發(fā)展過程中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移，自我更新，以及維持基底膜完整方面的作用[22-23]，但由于TACSTD2信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性，也存在很多不明確的潛在機(jī)制，了解TACSTD2蛋白的分子結(jié)構(gòu)，為該分子蛋白功能的研究方向提供了新的可能，為進(jìn)一步研究TACSTD2的作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。