托法替尼對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用及其機(jī)制*

李玲，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性疾病，該病以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、白質(zhì)炎性脫髓鞘、軸突變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生為病理特點(diǎn)[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確。研究表明，MS發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路異常有關(guān)，而Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcrip-tion，JAK-STAT)信號(hào)通路異常對(duì) MS發(fā)病有著重要作用[2]。托法替尼(tofacitinib)是一種新型JAK抑制劑，可通過(guò)阻斷JAK-STAT信號(hào)通路進(jìn)而抑制異常免疫反應(yīng)。目前托法替尼已被批準(zhǔn)為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床用藥[3]，除此之外，該藥對(duì)其他多種免疫性疾病，如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、銀屑病、腎移植排斥反應(yīng)等均顯示明顯治療作用[4-5]，但托法替尼用于治療MS的報(bào)道筆者較少見(jiàn)到。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用托法替尼干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型，觀察托法替尼對(duì)EAE是否具有腦保護(hù)作用，并探討相關(guān)作用機(jī)制，以期為托法替尼治療MS奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康豚鼠，體質(zhì)量0.25～0.3 kg；Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量0.2～0.25 kg。均購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-181。飼養(yǎng)溫度約24 ℃，飼養(yǎng)相對(duì)濕度約50%。

1.2試藥 托法替尼(美國(guó)輝瑞公司，批號(hào)：H20170121)；完全福氏佐劑(complete Freud's adjuvant，CFA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：Lot#SLBW5971)；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX，上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：20180109)；鼠抗髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)抗體(1：200，上海安研生物試劑銷售公司，批號(hào)：20180120)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(1：160，上海安研生物試劑銷售公司，批號(hào)：20180211)； 鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase，SP)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司，批號(hào)：20180204)；多聚甲醛。

1.3方法

1.3.1免疫抗原的制備 苯巴比妥 100 mg·kg-1致豚鼠死亡，無(wú)菌條件下迅速分離脊髓，除去脊膜，稱重后移入玻璃勻漿器，與等量0 ℃、0.9%氯化鈉溶液混合后研磨成50%全脊髓勻漿(whole spinal cord homogenate，WSCH)。CFA與WSCH等體積混合，玻璃注射器抽打至油包水乳狀，以滴在水面5 min不散為合格抗原。

1.3.2模型的制備與動(dòng)物分組 取Wistar雌性大鼠50只，采用完全隨機(jī)法分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及托法替尼小、中、大劑量組，每組10只。模型對(duì)照組及托法替尼小、中、大劑量組大鼠雙側(cè)后肢足掌皮下注入MBP與CFA，0.2 mL·(100 g)-1，建立模型；正常對(duì)照組注入等量無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液與CFA[6]。建模后當(dāng)天及第2天，將PTX注入各組大鼠腹腔，每只0.2 mL，加強(qiáng)免疫反應(yīng)。

1.3.3模型的干預(yù) 托法替尼小、中、大劑量組自造模前3 d開(kāi)始連續(xù)10 d分別灌胃托法替尼1，2，4 mg·kg-1·d-1，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等容量0.9%氯化鈉溶液。

1.3.4模型的評(píng)價(jià) 由同一人自建模后每天上午評(píng)判大鼠臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能障礙評(píng)分(neurological dysfunction score,NDS)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)臨床癥狀為0分；尾部癱瘓拖地，輕度后肢無(wú)力為1分；中度單側(cè)后肢或雙側(cè)后肢無(wú)力為2分；重度雙側(cè)后肢無(wú)力為3分；四肢全癱、大小便失禁為4分；抽搐、瀕死或死亡為5分[7]。

1.3.5實(shí)驗(yàn)終止 在發(fā)病高峰期(癥狀評(píng)分連續(xù)3 d無(wú)加重、四肢全癱或死亡)處死大鼠，未發(fā)病大鼠飼養(yǎng)8周后處死。

1.3.6神經(jīng)病理組織的制備 無(wú)菌條件下，組織剪剖開(kāi)大鼠頭頂部皮膚，暴露枕骨大孔及頂骨，沿枕骨大孔用鑷子去除顱蓋骨，暴露腦組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗除去血跡后輕柔取出。將腦組織在4%多聚甲醛液中固定48 h，分別予70%，80%，95%梯度乙醇及無(wú)水乙醇脫水，送我院病理教研室做腦組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色及腦組織免疫組化染色檢查。

1.3.7腦組織病理學(xué)觀察 腦組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后，取厚度10 μm連續(xù)矢狀位行石蠟切片，每間隔100 μm取片l張。經(jīng)烘干、脫蠟后行腦組織HE染色、觀察CNS炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

1.3.8腦組織髓鞘脫失、星型膠質(zhì)細(xì)胞活化情況檢測(cè) 腦組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、修復(fù)、0.3%過(guò)氧化氫(H2O2)溶液去除過(guò)氧化物酶活性、山羊血清封閉組織蛋白后，逐次滴加1：200鼠抗MBP單克隆抗體及1：160兔抗GFAP多克隆抗體恒溫孵育60 min，加入二抗孵育及鏈霉素卵白素孵育，常規(guī)二氨基聯(lián)苯氨(diamine bezidin,DAB)顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。采用ImagePr-Plus5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定MBP免疫組化陽(yáng)性面積，GFAP免疫組化染色切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，對(duì)陽(yáng)性表達(dá)的胞計(jì)細(xì)數(shù)，求其平均值。采用cM0s多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色進(jìn)行定量分析，測(cè)定MBP免疫組化陽(yáng)性表達(dá)、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值積分(IA)。

2 結(jié)果

2.1大鼠發(fā)病情況 模型對(duì)照組與托法替尼各劑量組潛伏期、進(jìn)展期及NDS均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，托法替尼各劑量組間比較，除大、中劑量組NDS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠發(fā)病情況比較

組別潛伏期進(jìn)展期dNDS/分模型對(duì)照組10.20±1.9910.50±1.843.80±1.03托法替尼 小劑量組16.70±1.50①8.00±2.00①2.30±1.34① 中劑量組20.20±2.44①②5.60±1.51①②1.20±1.40①③ 大劑量組22.90±1.79①②④3.00±1.16①②④0.60±0.84①②F78.4837.6214.31P<0.01<0.01<0.01

①與模型對(duì)照組比較，P<0.01；②與托法替尼小劑量組比較，P<0.01；③與托法替尼小劑量組比較，P<0.05；④與托法替尼中劑量組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01；②compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.05；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

2.2大鼠腦組織病理學(xué)變化 模型對(duì)照組及托法替尼各劑量組病理評(píng)分均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1。

表2 4組大鼠腦組織HE染色病理評(píng)分

組別HE染色病理評(píng)分/分模型對(duì)照組3.30±0.68托法替尼 小劑量組 2.50±0.85① 中劑量組1.50±0.97②③ 大劑量組0.70±0.68②③④F20.07P<0.01

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與托法替尼小劑量組比較，P<0.01；④與托法替尼中劑量組比較，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.05.

2.3大鼠腦組織脫髓鞘及星型膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 模型對(duì)照組與托法替尼各劑量組腦組織MBP陽(yáng)性表達(dá)平均A值、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均A值均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.01)，見(jiàn)表3～4。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)選用雌性 Wistar大鼠建立EAE模型，EAE大鼠在免疫后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、食量和體質(zhì)量下降，在發(fā)病高峰期出現(xiàn)尾部拖地，前后肢癱瘓，抽搐甚至死亡。其腦組織HE染色結(jié)果顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并在血管周圍形成典型的“袖套樣”炎癥細(xì)胞結(jié)構(gòu)。所以從EAE大鼠的臨床表現(xiàn)及腦組織的病理學(xué)改變，可以確定本實(shí)驗(yàn)EAE動(dòng)物模型誘導(dǎo)成功。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.托法替尼小劑量組；D.托法替尼中劑量組；E.托法替尼大劑量組。

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose tofacitinib group；D.median-dose tofacitinib group；E.high-dose tofacitinib group.

Fig.1HEstainingonthebrainsinfivegroupsofrats(×400)

表3 5組大鼠腦組織MBP陽(yáng)性表達(dá)平均A值

組別MBP陽(yáng)性表達(dá)平均A值/(×10-2)正常對(duì)照組13.33±0.33模型對(duì)照組4.34±0.32①托法替尼 小劑量組5.01±0.34①② 中劑量組8.44±0.20①②③ 大劑量組11.60±0.30①②③④F1712.56P<0.01

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與托法替尼小劑量組比較，P<0.01；④與托法替尼中劑量組比較，P<0.01。

①Compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

表4 4組大鼠腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均A值

組別GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均A值/(×10-2)模型對(duì)照組16.66±0.23托法替尼 小劑量組13.12±0.28① 中劑量組11.24±0.29①② 大劑量組9.18±0.30①②③F1339.83P<0.01

①與模型對(duì)照組比較，P<0.01；②與托法替尼小劑量組比較，P<0.01；③與托法替尼中劑量組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01；②compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；③compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

星型膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)分布非常廣泛，并參與BBB的構(gòu)成[17]。當(dāng)在腦組織受到自身抗體刺激后，星型膠質(zhì)細(xì)胞成為最先受損的腦細(xì)胞，可先于反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)免疫炎癥細(xì)胞遞質(zhì)(如腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素等)，啟動(dòng)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放細(xì)胞因子，趨化炎癥細(xì)胞邊集并穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[18]。星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化是EAE重要的發(fā)病機(jī)制之一。GFAP是星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的重要標(biāo)記物，其過(guò)度表達(dá)標(biāo)志著組織損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生[19]。研究發(fā)現(xiàn)，GFAP基因敲除小鼠EAE癥狀較野生型癥狀明顯加重[20]。本研究顯示，模型對(duì)照組大鼠腦組織星型膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯；而托法替尼各劑量組腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞平均A值較EAE組顯著減少。提示托法替尼可有效抑制腦組織內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞活化。

總之，托法替尼對(duì)EAE大鼠具有腦保護(hù)作用，并呈劑量依賴關(guān)系。減輕腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、減輕腦白質(zhì)脫髓病變、抑制腦組織內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是其作用機(jī)制之一。