一種二苯乙烯羥胺類化合物的合成及其在糖類檢測中的應(yīng)用研究

趙孔娥, 朱芳芳, 馬 傲, 朱 灝, 胡曉松

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

糖基化是修飾蛋白質(zhì)的重要方式[1]。修飾后的蛋白質(zhì)可參與到人體的各項(xiàng)生命活動中，如細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫、信息傳遞等[2]。糖基化異常與很多疾病有關(guān)[2-3]。因此針對糖蛋白的聚糖進(jìn)行監(jiān)測分析對疾病的診斷與治療有重要意義。然而，由于糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、離子化效率較低，也不具備生色團(tuán)，用常規(guī)的有機(jī)波譜分析方法開展其結(jié)構(gòu)研究十分困難[4]。在分析聚糖前通常需要進(jìn)行衍生化處理。近來，結(jié)合穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析成為定量糖組學(xué)研究中最可行的策略之一。對化學(xué)上相似的聚糖采用含“輕”和“重”的穩(wěn)定同位素的衍生試劑進(jìn)行衍生，不僅能有效消除電離效率的差異，還可以同時對多個樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，“輕”和“重”同位素標(biāo)記的聚糖衍生物質(zhì)譜峰具有明顯的質(zhì)荷比區(qū)別；通過比較它們的相對強(qiáng)度，可以獲得具有相同化學(xué)特征的聚糖的相對含量。常見的用于聚糖定量分析的衍生方法包括全甲基化法[11]，還原胺化法[12-14]和腙化法[15]。所有這些定量策略都是通過用H和D(或12C和13C)修飾的同位素標(biāo)記試劑和聚糖反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。

羥胺類化合物由于具有很高的親和性及其它特定的性質(zhì)，在化學(xué)合成、藥物化學(xué)以及化學(xué)生物學(xué)方面得到了廣泛的應(yīng)用[16]。O-取代和N-取代羥胺類衍生物已經(jīng)在醛類化合物的檢測分析中取得了一系列成果[4,17-18]，也可以用于聚糖分子的衍生分析。在大多數(shù)情況下，O-取代羥胺類衍生化反應(yīng)通過氨氧基與醛基反應(yīng)形成肟，然后進(jìn)一步被還原后進(jìn)行定量分析。而N-取代的羥胺類衍生化反應(yīng)是通過-NHOH與醛基反應(yīng)形成硝酮類化合物，直接用于定量分析[17],也可以進(jìn)一步被還原(Chart 1)。二苯乙烯的π共軛有機(jī)體系具有較高的光學(xué)可調(diào)控性和拓展性[19, 20]，是一個良好的熒光基團(tuán)。二苯乙烯片段可以通過苯乙烯參與的Heck反應(yīng)制得，如果選擇全氘代苯乙烯(styrene-d8)為原料，則可以制得氘標(biāo)記的重原子同位素探針?；谶@些分析，我們設(shè)計(jì)、合成了二苯乙烯類羥胺化合物(5a和5b, Scheme 1)，并初步用于糖類分子的檢測。

本文按照Scheme 1的合成路線合成了二苯乙烯類羥胺化合物：先以4-溴苯丙醇(1)和苯乙烯為原料，在醋酸鈀的催化下通過Heck反應(yīng)得到(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙烷-1-醇(2a)；2a被2-碘?；郊姿?IBX)氧化為(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙醛(3a)；3a再與鹽酸羥胺反應(yīng)得到(E)-3-(4-苯乙烯基苯基)丙醛肟(4a)；丙醛肟4a在酸性條件下被氰基硼氫化鈉還原為(E)-N-(3-(4-苯乙烯基苯基)丙基)羥胺(5a)，總產(chǎn)率為4.8%。采用相同的路線，以全氘代苯乙烯為起始原料，合成了(E)-N-(3-(4-(2-(苯基-d5)乙烯基-1,2-d2)苯基)丙基)羥胺(5b)。化合物5a和5b可以分別作為“輕”和“重”的穩(wěn)定同位素衍生試劑?；衔锝Y(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR, IR和LC-MS(ESI)表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)儀；UV757CRT型紫外-可見分光光度計(jì)；Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片)；Triple TOFTM5600型質(zhì)譜儀；G2-XS QTof型質(zhì)譜儀；LS55型熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(jì)；ZF-7A型手提式紫外分析儀。

4-溴苯丙醇(Adamas)；苯乙烯(Alfa Aesar)； 2-碘酰基苯甲酸(IBX)(Innochem)；叔丁醇(Aladdin)；鹽酸羥胺(阿拉丁)；氰基硼氫化鈉(Innochem)；N,N-二異丙基乙胺(上海秦巴化工有限公司)；三苯基膦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；麥芽三糖(DP3)、麥芽五糖(DP5)和麥芽七糖(DP7)(西寶生物科技)；其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 合成

(1)2a的合成

將化合物10.22 g(1.00 mmol)， 10 mol%Pd(OAc)222.45 mg(0.10 mmol)， 20 mol%乙酰丙酮20.01 mg(0.2 mmol)， 10 mol%四丁基溴化銨(TBAB)32.24 mg(0.1 mmol)， Cs2CO3651.64 mg加入DMSO(2 mL)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入苯乙烯312.45 mg(3.00 mmol)，于120 ℃反應(yīng)2 h。冷卻至室溫，用EtOAc(100 mL)稀釋，依次用飽和氯化銨溶液(2×100 mL)，飽和食鹽水(2×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱層析純化得淡黃色固體2a，產(chǎn)率81.6%, Rf=0.38(石油醚/乙酸乙酯=3/1,V/V), m.p.73.9～75.0 ℃;1H NMR(500 MHz,CHLOROFORM-d)δ: 7.53(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.43～7.49(m,J=7.6 Hz, 2H), 7.37(t,J=7.2 Hz, 2H), 7.17～7.24(m,J=7.3 Hz, 2H), 7.04～7.15(m, 2H), 3.71(t,J=6.1 Hz, 2H), 2.74(t,J=7.5 Hz, 2H), 1.93(quin,J=6.9 Hz, 2H), 1.62(br s, 1H), 1.37(br. s, 1H), 0.10(s, 1H);13C NMR(126 MHz)δ: 141.4, 137.5, 135.1, 128.8, 128.6, 128.5, 128.0, 127.4, 126.6, 126.4, 77.3, 76.7, 62.2, 34.1, 31.8, 1.0; IRν: 3263, 3023, 2938, 2863, 2363, 1594, 1447, 1058,1016, 967, 812, 749, 692, 529 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H18O{[M+H]+}239.1436, found 239.1427。

Chart 1

Scheme 1

(2)3a的合成

依次將化合物2a0.10 g(0.42 mmol)、 IBX 0.24 g(0.84 mmol)加入13 mL叔丁醇中，回流(82 ℃)反應(yīng)4 h(TLC檢測)。經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=6/1,V/V)純化得淡黃色粉末3a，產(chǎn)率64.6%, Rf=0.5(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.55.8～58.0 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.72(s, 1 H), 7.58(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.52(d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.37(t,J=7.5 Hz, 3H), 7.16～7.32(m, 4H), 2.87(t,J=7.3 Hz, 2H), 2.78(t,J=7.3 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz , DMSO-d6)δ: 203.2, 140.8, 137.6, 135.3, 129.1, 129.1, 128.7, 128.2, 128.0, 127.0, 126.8, 44.7, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.8, 39.7, 27.7; IRν: 3024, 2929, 2850, 2820, 2721, 1713, 1595, 1513, 1489, 1449, 1405, 1388, 969, 819, 753, 691, 548 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H16O{[M+H]+}237.1279, found 237.1273。

(3)4a的合成

將化合物3a100.00 mg(0.43 mmol)加入混合溶劑(四氫呋喃/水=1/1,V/V)4 mL中，加入鹽酸羥胺45.00 mg(0.65 mmol)，用2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)至pH 4,于室溫反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測)。旋蒸除溶，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=6/1,V/V)純化得白色固體4a，產(chǎn)率45.7%, Rf=0.33(石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V), m.p.101.2～102.4 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 10.81(s, 1H), 7.59(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.53(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.37(t,J=7.6 Hz, 3H), 7.19～7.31(m, 4H), 6.68(t,J=5.2 Hz, 1H), 2.72～2.79(m, 2H), 2.53～2.60(m, 2H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 150.0, 141.3, 137.6, 135.3, 129.2, 129.1, 128.7, 128.2, 128.0, 127.0, 126.9, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.8, 39.7, 31.7, 26.6; IRν: 3209, 3087, 3027, 2871, 2362, 1665, 1490, 1447, 1324, 1073, 966, 691 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H17NO{[M+H]+}252.1388, found 252.1379。

(4)5a和5b的合成(以5a為例)

將化合物4a33.7 mg(0.13 mmol)溶解于1 mL甲醇中，分批加入NaCNBH346.5 mg(0.74 mmol)，用氯化氫的飽和甲醇溶液調(diào)至pH為弱酸性，反應(yīng)6 h。旋蒸除溶，殘余物預(yù)過柱，收集有機(jī)層再經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)純化得化合物5a，產(chǎn)率20%, Rf=0.3(石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V), m.p.111.2～113.0 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.58(d,J=7.3 Hz, 2H),7.41～7.54(m, 2H), 7.36(t,J=7.5 Hz, 2H), 7.09～7.31(m, 5H), 2.67～2.76(m, 1H), 2.57～2.65(m, 2H), 1.64～1.88(m, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 141.2, 141.0, 137.6, 135.4, 131.7, 131.1, 129.2, 129.2, 128.7, 128.2, 128.0, 128.0, 127.1, 127.0, 126.9, 126.8, 56.7, 56.6, 40.5, 40.3, 40.2, 40.0, 39.7, 32.3, 31.9, 26.5, 26.4; IRν: 3023, 2854, 2364, 2329, 1726, 1549, 1452, 1373, 1265, 1105, 1075, 964, 809 cm-1; LC-MSm/z: calcd for C17H19NO{[M+H]+}254.1545, found 254.1539。

用類似的方法合成5b, Rf=0.3(石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V), m.p.148.2～150.3 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 9.59, 9.17(d,J=4.0 Hz, 1H), 7.56～7.51(m,J=7.9 Hz, 2H), 7.24～7.19(m,J=8.2 Hz, 2H), 2.94～2.81(m, 2H), 2.68～2.57(m, 2H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 140.6, 136.9, 134.8, 128.6, 56.2, 40.0, 39.8, 39.7, 39.3, 39.2, 39.0, 31.8, 25.9; LC-MSm/z: calcd ford7-C17H12NO{[M+H]+}261.1984, found 261.1982。

1.3 性能測試

(1) UV-Vis

分別使用乙腈和DMSO配制5.0 μmol·L-1化合物5a的溶液。并分別以乙腈和DMSO作為空白對照，在260～400 nm掃描UV-Vis譜圖。

(2) FL

使用DMSO配制1.0 μmol·L-1化合物5a的溶液，在230～500 nm掃描FL譜圖。

(3) 熒光量子產(chǎn)率[21]

配制1.0μmol·L-1化合物5a的DMSO溶液作為待測溶液，2.0 μmol·L-1硫酸奎寧的0.1 mol·L-1硫酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度和折射率，并計(jì)算發(fā)射峰積分面積。

(4)5a與麥芽三糖衍生體系的熒光性能

將20 μL 化合物5a(1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1DP3溶液和10 μLNH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻，于60 ℃反應(yīng)5 h。每隔1 h取樣，在230～500 nm掃描FL譜圖。

(5)5a與聚糖衍生反應(yīng)

將20 μL 化合物5a(1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1聚糖混合溶液(DP3、 DP5和DP7)與10 μL NH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻,于60 ℃反應(yīng)3 h。濃縮，真空干燥，加入10%乙腈溶液，經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾，進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

(6)1H和D標(biāo)記的二苯乙烯羥胺化合物與DP5衍生反應(yīng)

將20 μL同位素標(biāo)記混合物(化合物5a/5b=1/1, 1 mmol·L-1)、 10 μL 0.01 mmol·L-1DP5溶液和10 μL NH4Ac/HAc(0.2 mol·L-1, pH=3.5)混合均勻,于60 ℃反應(yīng)3 h。濃縮，真空干燥，加入10%乙腈溶液，經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾，進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以4-溴苯丙醇為初始原料，嘗試以兩種不同的Heck反應(yīng)條件合成化合物2a。首先用醋酸鈀，三苯基膦和N,N-二異丙基乙胺作催化劑，產(chǎn)率較低(23.8%)；后來采用醋酸鈀，四丁基溴化銨和碳酸銫作催化劑，產(chǎn)率較高(81.6%)。原料中的溴原子為Heck反應(yīng)提供了便利條件，確保醋酸鈀中的鈀元素由二價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化為零價(jià)態(tài)，使得催化反應(yīng)可以順利進(jìn)行。雖然構(gòu)建二苯乙烯結(jié)構(gòu)乙烯橋的方法有很多，如Wittig反應(yīng)[22]，Heck反應(yīng)[23]和Suzuki反應(yīng)[24]等，但文獻(xiàn)[25-26]表明使用Heck反應(yīng)合成E-型苯乙烯基化合物的效率最高。

化合物3a可以通過氧化2a得到。本文采用氯鉻酸吡啶鹽(PCC)和鄰碘酰基苯甲酸兩種不同的氧化劑進(jìn)行了氧化反應(yīng)。以PCC為氧化劑時，反應(yīng)時長為3 h，產(chǎn)率為40%；以鄰碘?；郊姿釣檠趸瘎r，反應(yīng)時長縮短至2 h，產(chǎn)率升高至64.6%，且操作簡便。因此最終采用鄰碘?；郊姿嶙鳛檠趸瘎?。

化合物3a經(jīng)過肟化反應(yīng)和還原反應(yīng)分別得到化合物4a和5a。由于反應(yīng)原料在氯化氫/甲醇飽和溶液中的溶解度不高，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率較低。由化合物5a的傅里葉紅外光譜可知，其烯烴結(jié)構(gòu)的=C—H面外搖擺振動在964 cm-1處有一個強(qiáng)的吸收峰，在730～650 cm-1沒有弱且寬的吸收峰，因此可判定其雙鍵為反式結(jié)構(gòu)。

2.2 紫外-可見吸收光譜

化合物5a的UV-Vis譜圖如圖1所示。由圖1可見，化合物5a在乙腈和DMSO中的主要特征吸收峰均為兩個，這證明了分子內(nèi)存在不同類型的電子躍遷?；衔?a在DMSO中的吸收峰位于302 nm和312 nm，在乙腈中位于300 nm和310 nm。受溶劑效應(yīng)影響，化合物5a在乙腈中的吸收峰相比于DMSO中的吸收峰發(fā)生了藍(lán)(紫)移，吸收峰強(qiáng)度也更強(qiáng)。

λ/nm

2.3 熒光光譜和熒光量子產(chǎn)率

化合物5a在DMSO中的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜如圖2所示。其激發(fā)波長為312 nm，發(fā)射波長為357 nm，斯托克斯位移為45 nm(表1)。使用硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)品，測得化合物5a的熒光量子產(chǎn)率為0.11，摩爾吸光系數(shù)為1.02×104cm-1·mol-1·L。

λ/nm

表1 化合物4的物理化學(xué)性質(zhì)

2.4 5a與麥芽三糖衍生體系熒光隨時間的變化

化合物5a熒光性能較好，斯托克斯位移為45 nm，且具有較強(qiáng)的抗背景干擾能力。我們期望化合物5a與糖的衍生產(chǎn)物也具有良好的熒光性能。但是由圖3可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度在逐漸降低，3 h之后熒光強(qiáng)度幾乎不再改變，說明化合物5a與麥芽糖的衍生反應(yīng)沒有生成熒光性能顯著增強(qiáng)的衍生產(chǎn)物。

λ/nm圖3 5a與DP3衍生體系的FL譜圖

2.5 聚糖衍生物的質(zhì)譜分析

雖然化合物5a很難用于聚糖分子基于熒光衍生的相關(guān)研究，但仍能通過衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜來實(shí)現(xiàn)聚糖的檢測和定量分析?；衔?a分別與麥芽三糖(DP3)、麥芽五糖(DP5)和麥芽七糖(DP7)進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，所得到的衍生產(chǎn)物對應(yīng)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度較高(圖4)。質(zhì)譜結(jié)果顯示，化合物5a與聚糖衍生同時被還原，衍生產(chǎn)物質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比相較于理論值增加了兩個氫原子的原子量(表2)，這可能是衍生反應(yīng)得到的硝酮在質(zhì)譜離子化過程中進(jìn)一步還原的結(jié)果(圖5)。

圖 4 化合物5a與DP3、 DP5、 DP7衍生物的MS譜圖

Figure 4 MS spectrometry of the derivatives of 5a and DP3, DP5, DP7

圖5 化合物5a與聚糖的硝酮化反應(yīng)和還原反應(yīng)

表 2 化合物5a與聚糖衍生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

2.6 1H和D標(biāo)記的二苯乙烯羥胺化合物與DP5衍生反應(yīng)的質(zhì)譜

近年來，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的試劑已被證明是對簡單和復(fù)雜混合物中N-連接聚糖進(jìn)行相對定量的可行策略[21-24]。化合物5a和5b等量混合后與DP5進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到的衍生物的質(zhì)譜圖如圖6所示。5a和5b與DP5的衍生物加氫峰的質(zhì)荷比分別為1066.4244和1073.4739，相差為7，強(qiáng)度比接近1。衍生條件相對溫和，質(zhì)譜信號的強(qiáng)度高，“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標(biāo)記的二苯乙烯羥胺探針能夠較好的標(biāo)記聚糖，衍生產(chǎn)物的離子化效果基本相同，可以將成對出現(xiàn)、質(zhì)荷比相差為7的質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)度用于定量分析的依據(jù)。這說明該類探針在聚糖的定量分析中有比較廣闊的應(yīng)用前景。

m/z

設(shè)計(jì)并合成了新型二苯乙烯類羥胺化合物(化合物5a,5b)。化合物5a的激發(fā)波長為312 nm，發(fā)射波長為357 nm，斯托克斯位移為45 nm，熒光量子產(chǎn)率為0.11，在發(fā)生衍生反應(yīng)之前具有較好的熒光性能。5a和5b按1/1與麥芽五糖進(jìn)行衍生化反應(yīng)時，得到了成對出現(xiàn)，分子量相差為7的穩(wěn)定同位素標(biāo)記產(chǎn)物。這些質(zhì)譜信號的強(qiáng)度可以作為定量分析的依據(jù)，“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標(biāo)記的化合物5a和5b聯(lián)合使用時，可以基于硝酮化反應(yīng)和質(zhì)譜技術(shù)，在聚糖和其它醛類分子的定量分析中發(fā)揮作用。我們將在后期的工作中引入四苯乙烯或其它熒光性能更好的砌塊，從而得到既能作為熒光探針，又可以用于質(zhì)譜分析的多功能分子，進(jìn)一步拓展其在糖類檢測中的應(yīng)用。